通天草提取物对Aβ1-40所致老年痴呆大鼠基底核超微结构影响

敖鹏，边晓燕，费洪新，李宝龙，贾博宇，房城，王晓源

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

通天草提取物对Aβ1-40所致老年痴呆大鼠基底核超微结构影响

敖鹏，边晓燕，费洪新，李宝龙，贾博宇，房城，王晓源*

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：观察通天草提取物对Aβ1-40,所致老年痴呆(AD)模型大鼠基底核超微结构的影响，探讨其防治AD的形态学机制。方法：实验分正常组、模型组、通天草水提组、通天草醇提组和中药对照组进行。使用Aβ1-40制备AD大鼠模型，于造模后第7天开始用药，连续用药21天后，取大脑基底核组织，应用透射电镜观察其超微结构改变。结果：模型组，部分神经元细胞核膜皱缩；线粒体肿胀明显，粗面内质网扩张；高尔基复合体扁平囊泡结构融合；突触数量与突触小泡均减少。通天草醇提组和水提组基底核超微结构的损伤明显低于模型组，其中醇提组的作用优于水提组。结论: 通天草提取物能够改善Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微结构损伤，对神经元细胞具有一定的修复和保护作用。

通天草提取物；老年性痴呆；基底核；超微结构

老年痴呆症，又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一种神经系统退行性疾病，主要以记忆障碍、失语、视空间技能损伤等为特征，病因迄今尚未十分明确。本文采用透射电镜技术，系统观察了通天草提取物对Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微结构的影响，探讨该提取物防治AD的形态学机制及药用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、药品和仪器

Aβ1-40(Amyloid β-protein,Fragment 1-40)由Sigma公司提供；通天草水提物和醇提物，由黑龙江中医药大学药学院提供；脑复康片剂(400 mg/片)，东北制药厂生产；注射用青霉素钠，哈药集团生产；透射电子显微镜，TECNAI G2型，美国FEI公司制造；超薄切片机，德国莱卡公司制造。

1.2 动物与分组

成年清洁级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量(300±20)g，由黑龙江中医药大学动物中心提供。将动物适应性喂养1周后进行跳台实验，剔除不合格鼠，随即分成正常组、模型组、通天草水提组、通天草醇提组、中药(脑复康)对照组，每组10只。

1.3 模型制备

按照本课题组前期研究成果的方法，进行模型制备[1]。

1.4 动物给药

各实验组在造模第7天实施灌胃给药，连续给药21天，1次/d，给药剂量分别为：醇提组1.18 g/(kg·d)；水提组2.90 g/(kg·d)；中药组0.7 g/(kg·d)；正常组与模型组大鼠给予同等体积的饮用水。

1.5 透射电镜样品取材与制备

各实验组在给药21 d后，用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)行腹腔麻醉，经左心室和主动脉灌注4%多聚甲醛和3%戊二醛混合液固定脑组织，参照大鼠脑图谱[2]在解剖显微镜下剥离基底核，每例切取大致相同的部位，大少为1×2×2 mm3，置于3%戊二醛中预固定，磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，Epon812浸透、包埋、聚合。使用超薄切片机切取半薄切片(500 nm)，光学显微镜下进行核团定位后，再进行超薄切片(50 nm)，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察拍照。

2 结果

2.1 正常组超微结构

神经元细胞：多成圆锥形，核大而圆，核膜圆滑，核仁清晰(图1A)；线粒体散在分布于胞浆内，并可见粗面内质网、核糖体、高尔基复合体(图1B)。突触：神经纤维间可见丰富的突触结构，突触前成分内富含大小不一的突触小泡和线粒体等；突触厚膜胞浆面有致密物质，突触间隙清晰(图1C)。

2.2 模型组超微结构病变

神经元细胞：核形不规则，核膜凹陷或融合(图2A)；线粒体肿胀明显，导致脊断裂和内外膜破损；粗面内质网扩张且脱颗粒，核糖体减少；高尔基复合体扁平囊泡结构融合(图2B)。突触：神经元突触数目和突触小泡明显减少，突触后膜致密物质融合或电子密度降低，部分突触间隙消失(图2C)。

2.3 通天草水提组超微结构改善

神经元细胞：细胞核形不尽规则，核膜有轻度下凹(图3A)；线粒体仍见肿胀、部分脊断裂；粗面内质网扩张；高尔基复合体损伤轻于模型组(图3B)。突触：突触数目未见明显减少，部分突触小泡减少；部分突触后膜致密物质密度下降，偶见突触间隙消失(图3C)。

2.4 通天草醇提组超微结构改善

神经元细胞：细胞核形尚规则(图4A)；少数线粒体轻度肿胀、个别线粒体脊损伤；粗面内质网、核糖体、高尔基复合体较发达且形态近于正常组(图4B)。突触：突触数目及突触小泡均未见减少；有的突触后膜致密物质密度下降，个别突触间隙结构欠清晰(图4C)。醇提组超微结构改善优于水提组。

2.5 中药对照组超微结构改善与醇提组近似(图5)。

A.正常组神经元细胞(2 550×) B.正常组细胞器(16 500×) C.正常组突触(20 500×)图1 正常组超微结构电镜图

A.模型组神经元细胞(2 550×) B.模型组细胞器(16 500×) C.模型组突触(16 500×)图2 模型组超微结构电镜图

A.水提组神经元细胞(2 550×) B.水提组细胞器(16 500×) C.水提组突触(16 500×)图3 水提组超微结构电镜图

A.醇提组神经元细胞(2 550×) B.醇提组细胞器(16 500×) C.醇提组突触(16 500×)图4 醇提组超微结构电镜图

A.中药组神经元细胞(2 550×) B.中药组细胞器(16 500×) C.中药组突触(16 500×)图5 中药组超微结构电镜图

3 讨论

3.1 Aβ沉积与AD的发病机制[3-6]

AD的发病机制十分复杂，β淀粉样蛋白被公认为是诱发AD发病的关键因素之一。AD的病理学特征是脑组织细胞外老年斑形成，其主要成分为β淀粉样蛋白。近年研究报道：Aβ通过不同机制不仅作用于神经元细胞外，也作用于细胞内，共同诱发AD的发病。它存在于线粒体、内质网、高尔基复合体等多种细胞器中。可导致线粒体损伤，膜电位下降，致使细胞内钙失衡；造成内质网发生应激性反应，使其调节酶Grp78和磷酸化eIF2α水平升高；引发突触结构改变，细胞信息传导障碍。本实验采用Aβ1-40制备AD模型，观察到神经元细胞内线粒体等多种细胞器发生超微结构病变，为细胞内Aβ的毒性作用提供了形态学依据。

3.2 突触损伤与减少是造成AD的主要原因之一

大量临床研究和基础实验显示，老年痴呆症与神经元突触的损伤和减少密切相关。Holtzman DM等研究人员，采用Aβ1-42疫苗治疗AD并进行流行病学统计。对参与治疗的病人，将生前认知功能测试结果和死后尸检病理统计结果对比分析，表明：Aβ沉积、 神精纤维缠结与 AD的认知功能无显著差异[7]，并发现AD发病前就出现神经突触消失，随着时间的推移，可出现轻度、中度、重度认知障碍直至痴呆。文献认为：神经元突触消失是AD发生发展的主要因素[8-11]。

本实验模型组，神经元细胞不仅出现线粒体等细胞器的超微结构损伤，而且还出现了突触融合和明显减少等病变。线粒体的主要功能是提供能量，粗面内质网、高尔基复合体是完成蛋白质合成分泌、加工及运输的重要场所；上述细胞器的病变，可能是引发突触损伤和减少的主要原因；而突触减少会影响神经递质的储存、释放以及功能蛋白的相互作用，致使信息传导受阻，神经功能紊乱，引发AD。

3.3 通天草提取物对Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微结构的改善

基底核由位于大脑皮层底下一系列神经核团组成，其主要功能为自主运动的控制、意识活动的调节和运动反应，同时还参与记忆、情感等高级认知功能。基底核的病变可导致多种运动和认知障碍。

关于中医药对实验性AD动物模型的治疗作用报道，多见于对大脑皮质和海马组织的观察，而对基底核的观察报道较少。

本课题组前期研究成果报道，通天草提取物能够调节Aβ1-40所致AD大鼠血液和海马组织中的细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，对β样淀粉蛋白沉积引发的免疫炎症反应具有一定的调控作用[12-13]。本实验在前期工作的基础上，又观察了该提取物对AD大鼠基底核的影响。观察结果显示，模型组，神经元细胞线粒体病变最为严重；通天草治疗组，线粒体损伤明显减轻，与其它细胞器相比改善最为显著。作者认为，通天草的作用机制可能是通过阻断Aβ在线粒体中的沉积，而阻断Aβ的毒性作用，使细胞合成能量的主要场所得到保护，完成线粒体三羧酸循环和呼吸链传递的主要生化过程，从而使粗面内质网和高尔基复合体等细胞器获得正常能量，改善其超微结构的损伤。神经元细胞器结构和功能的恢复，则阻止了突触的损伤和减少。通天草提取物能够改善Aβ1-40所致AD大鼠基底核超微结构损伤，对神经元细胞具有一定的修复和保护作用，其中通天草醇提组优于水提组。

3.4 本实验的后期工作

本实验的后期工作将在透射电镜下，对神经元突触的减少与恢复程度进行体视学处理，得出统计学数据。

关于通天草提取物对Aβ沉积性大脑痴呆症的作用机制，还需要采用蛋白组学等实验方法进一步研究和探讨。

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2016-05-19

2016-12-20

国家自然科学基金面上项目(81373777)

敖鹏(1985-)，男，硕士，助理研究员，主要研究方向：抗衰老和类风湿防治。

*通讯作者：王晓源(1977-)，女，博士，副教授，黑龙江中医药大学中西医结合基础在站博士后，主要研究方向：中医药抗衰老。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0019-03