HLA-DQB1基因多态性与广西壮族女性HPV16感染和宫颈癌易感性的关联研究①

卢庭婷 梁惠萍 熊 灏 朱 华

(广西卫生职业技术学院，南宁530021)

HLA-DQB1基因多态性与广西壮族女性HPV16感染和宫颈癌易感性的关联研究①

卢庭婷 梁惠萍 熊 灏 朱 华

(广西卫生职业技术学院，南宁530021)

目的：探讨HLA-DQB1等位基因多态性对广西壮族女性HPV16感染和宫颈癌发生的影响，为寻找广西壮族女性宫颈癌的遗传易感基因或保护基因提供线索。方法：选取广西地区25～45岁宫颈癌确诊的壮族患者、无癌健康壮族女性各171例作为研究对象(按年龄±3岁配对)，采集研究对象样本并提取HPV核酸和人基因组DNA，分别应用PCR-SSP和分子导流杂交技术进行HLA-DQB1基因型检测和HPV基因分型检测，最后进行统计学分析。结果：(1)171例宫颈癌患者中HPV总感染率为91.22%，其中高危型病毒占90.76%， HPV16型为主要致病亚型(43.58%)；(2)广西壮族女性宫颈癌患者组的HLA-DQB1*04等位基因携带率高于无癌对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；等位基因HLA-DQB1*06/09在宫颈癌患者组中的携带率明显低于无癌组，差异具有统计学意义(P<0.05)；而两组间的HLA-DQB1*02/05/07/08等位基因携带率无显著性差异(P>0.05)；(3)HLA-DQB1*04基因在HPV16阳性宫颈癌患者中出现的频率明显高于HPV16阴性患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：HLA-DQB1*04可能是广西壮族女性宫颈癌发生的易感基因，HLA-DQB1*06/09可能是广西壮族女性宫颈癌的保护基因。而HLA-DQB1*02/05/07/08等位基因可能与广西壮族女性宫颈癌遗传易感性无关。携带HLA-DQB1*04等位基因的广西壮族妇女可能更容易感染HPV16型病毒，从而增加了其患宫颈癌的危险性。

HLA-DQB1；宫颈癌；遗传易感基因

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，病死率在女性生殖道恶性肿瘤中居首位，严重威胁着广大女性的生命健康[1]。近年来，我国年轻妇女宫颈癌的发病率呈现上升趋势，已引起广泛重视[2]。宫颈癌的发生是多因素多阶段的复杂过程，其中高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染作为宫颈癌发生的必要因素已经得到公认[3，4]。目前已发现的HPV有110多种亚型，约40种型别与生殖道感染有关[5]。根据致癌性HPV可分为高危型和低危型，高危型HPV有：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和73型等，其中HPV16型和HPV18型最为常见，据报道，70%的宫颈癌由HPV16型或HPV18型引起[6]。低危型HPV有：6、11、40、42、43、44和54型等，主要引起良性病变如尖锐湿疣等[7]。但并非所有的HPV感染者最终都发展为宫颈癌，有研究结果表明，在HPV致癌过程中协同宿主的遗传易感性是宿主感染HPV后是否发生肿瘤的关键性因素[8,9]。

人类白细胞抗原(HLA)和几乎所有免疫相关性疾病的发生有不同程度的关联，特别是自身免疫性疾病，肿瘤及感染性疾病[10]。1991年，Wank等[11]在《Nature》上首次报道了德国妇女HLA分子与宫颈鳞状细胞癌具有相关性。此后，国内外学者对HLA多态性与宫颈癌的关联性进行了大量的研究。由于种族和民族HLA的分布不同，因此HLA各等位基因在各种族和民族宫颈癌中出现频率的不同[12]，广西是多民族聚居的地区，在常住人口中，少数民族人口占总人口的37.18%，其中壮族人口占总人口的31.39%，其遗传背景有别于我国其他地区和民族。为了明确HLA-DQB1对广西壮族女性HPV感染和宫颈癌易感性的影响及相关性，本实验采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)和分子导流杂交技术，检测广西地区民族均为壮族的171例宫颈癌患者和171例宫颈细胞学正常的健康妇女的HLA-DQB1等位基因，并进行HPV基因分型检测，以初步探讨种族的遗传易感性在本民族宫颈癌发病中的作用，为寻找广西壮族女性宫颈癌的遗传易感基因或保护基因提供线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2014年12月至2016年6月期间确诊的宫颈癌患者(年龄在25～45岁)的标本171例，病例组为广西医科大学肿瘤医院、广西壮族自治区人民医院就诊及住院患者；对照组171例，来源于同期参加广西医科大学附属医院、广西壮族自治区人民医院宫颈癌筛查项目的年龄在25～45岁的健康女性。病例组和对照组均来自广西当地，民族均为壮族。所有对照均为HPV阴性，均无肿瘤病史，并与病例按年龄(±3岁)及生活习惯(性伴侣数、吸烟状态等)进行频数匹配，研究对象相互间均无血缘关系。本研究已通过伦理委员会的审批，所有研究对象均签署知情同意书并接受流行病学调查。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集与处理 将收集到的宫颈癌患者组和对照组的宫颈处上皮细胞样本洗脱于1 ml灭菌生理盐水中并转至1.5 ml无菌EP管中，12 000 r/min离心3 min，弃上清，样品沉淀中加入200 μl灭菌生理盐水，震荡30～60 s，充分悬浮细胞沉淀后，待用于提取HPV DNA。选用真空抗凝(EDTA)采血管分别采集宫颈癌患者组和健康对照组晨起空腹静脉血2 ml，混匀后进行500 μl/管分装，-80 ℃冰箱保存，待进行全血基因组DNA提取。

1.2.2 HPV核酸提取和人基因组DNA提取 HPV核酸的提取选用广州安必平医药科技有限公司的人乳头瘤病毒HPV核酸检测试剂盒，人基因组DNA的提取选用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 HPV基因分型检测 依据Genbank基因库，采用Premier5.0软件分别对HPV病毒高危型和低危型共21种亚型设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增按照TaKaRa试剂盒说明书进行操作，反应完成后进行HPV分子导流杂交，最后根据HPV分型图进行分型。感染两种或两种以上者为多重感染者。

1.2.4 HLA-DQ基因分型检测 采用PCR-SSP的方法，选用天津秀鹏公司的HLA-DQ基因分型低分辨测定试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行PCR，PCR反应结束后，按顺序将每个PCR反应产物6～7 μl 加样到2.0%的琼脂糖凝胶孔中。145 V电泳15 min，当内参质控带与阳性分型带清晰分开时即可停止电泳。

1.2.5 结果观察及判读 在紫外凝胶成像系统下观察结果并拍摄成像，根据试剂盒说明书中提供的基因亚型分型表来判读基因分型情况(图1、2)。

1.3 统计学处理 利用SPSS17.0统计软件进行数据分析，HLA-DQB1各基因位点分布频率在两组间比较采用χ2检验，同时计算OR值和OR值的95%可信区间(95%CI)用来估计相对危险度，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染情况及亚型分布 在171例宫颈癌患者中有156例患者感染HPV占91.22%，共计分离出195株HPV病毒(表1)。其中分离出高危型病毒177株，占分离出HPV病毒的90.76%；低危型病毒18株，占分离出HPV病毒的9.24%。156例HPV感染者中单一感染患者为126例(80.76%)，双重感染24例(15.38%)，三重感染3例(1.92%)，四重感染3例(1.92%)。本次研究中高危型HPV16是主要致病亚型，共检出85株(43.58%)，其余分别位于高危型中第二、三、四位的是HPV18型，检出24株(12.30%)，HPV52型检出21株(10.76%)，HPV58型检出18株(9.23%)。低危型只检出三型，分别为HPV54型，检出10株(5.12%)，HPV11型检出5株(2.56%)，HPV6型检出3株(1.53%)。

图1 HLA-DQB1等位基因的PCR扩增电泳图(患者组)Fig.1 PCR amplification electrophoresis of HLA-DQB1 allele(patient group)

图2 HLA-DQB1等位基因的PCR扩增电泳图(对照组)Fig.2 PCR amplification electrophoresis of HLA-DQB1 allele(control group)

2.2 HLA-DQB1各等位基因在宫颈癌患者组与无癌对照组中携带率的比较 由表2可见，等位基因HLA-DQB1*04/06/09的携带率在宫颈癌患者组与无癌对照组的比较,经统计学处理两组间差异有统计学意义(P<0.05)；HLA-DQB1*04基因在宫颈癌患者组的携带率高于无癌对照组(P<0.05)；HLA-DQB1*06/09基因在宫颈癌患者组中的携带率低于无癌对照组(P<0.05)；而HLA-DQB1*02/05/07/08在两组间的携带率经比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 HLA-DQB1各等位基因与HPV16感染的关系 在171例宫颈癌患者中HPV16感染占的比例最高，按照HPV感染的情况，将宫颈癌患者分为HPV16型阳性组和HPV16型阴性组(HPV16型阳性85例，HPV16型阴性86例)，由表3可见，等位基因HLA-DQB1*04出现的频率在HPV16阳性组与HPV16阴性组比较,经统计学处理两组间差异有统计学意义(P<0.05)，即等位基因HLA-DQB1*04在HPV16阳性者中出现的频率34.1%明显高于HPV16阴性者的8.1%(P=0.000)，而其他等位基因与HPV16感染的关系经统计学处理,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 广西壮族25～45岁宫颈癌患者感染HPV亚型分布情况

Tab.1 Distribution of HPV subtypes of 25 to 45 years old cervical cancer infection in Guangxi Zhuang

HPVsubtypeInfectionnumberProportion(%)High⁃riskHPV168543 58HPV182412 30HPV3152 56HPV3394 61HPV3963 07HPV522110 76HPV58189 23HPV5931 53HPV6621 02HPV6842 05Low⁃riskHPV631 53HPV1152 56HPV54105 12Total195100 00

表2 宫颈癌患者组与无癌对照组中HLA-DQB1各等位基因携带率比较[n(%)]

Tab.2 Allele carrying rate of HLA-DQB1 in cervical cancer group was compared with that in control group[n(%)]

AlleleCervicalcancergroup(n=171)nCarryingrate(%)Controlgroup(n=171)nCarryingrate(%)χ2POR95%CIDQB1∗023621 1%3922 8%0 1540 6950 9030 541-1 507DQB1∗043621 1%127 0%13 9590 0003 5331 768-7 062DQB1∗0510259 6%9153 2%1 4390 2301 3000 847-1 995DQB1∗063319 3%6336 8%13 0340 0000 4100 251-0 670DQB1∗074526 3%4124 0%0 2490 6181 1320 694-1 847DQB1∗08158 8%95 3%1 6130 2041 7310 736-4 070DQB1∗092414 0%4224 6%6 0830 0140 5010 288-0 873

表3 HLA-DQB1各等位基因与HPV16感染的关系

Tab.3 Relationship between HPV16 infection with HLA-DQB1 alleles

AllelenHPV16(+)[n=85，n(%)]HPV16(-)[n=86，n(%)]χ2POR95%CIDQB1∗023619(22 4%)17(19 8%)0 1720 6781 1680 560-2 440DQB1∗043629(34 1%)7(8 1%)17 3580 0005 8442 391-14 283DQB1∗0510248(56 5%)54(62 8%)0 7090 4000 7690 417-1 418DQB1∗063312(14 1%)21(24 4%)2 9130 0880 5090 232-1 114DQB1∗074518(21 2%)27(31 4%)2 3020 1290 5870 294-1 172DQB1∗08158(9 4%)7(8 1%)0 0860 7691 1730 405-3 391DQB1∗092411(12 9%)13(15 1%)0 1680 6820 8350 351-1 984

3 讨论

本研究采用分子导流杂交技术对广西壮族171例宫颈癌患者进行宫颈HPV基因分型检测，其中有156例患者感染HPV占91.22%，共计分离出195株HPV病毒。其中分离出高危型病毒占90.76%，高危型中HPV16型是主要致病亚型，这与国内外报道的导致宫颈癌发生的HPV型别中，HPV16型感染居首位的结果相一致[13，14]。

近年来，对HLA-DQ基因多态性与HPV感染和宫颈癌易感性的研究已经逐渐成为HLA系统研究的热点[15]。但国内外研究报道的结果存在不一致性，例如，李亚伟等[16]认为，HLA-DQB1*02和HLA-DQB1*03可能是新疆维吾尔族HPV16感染的中晚期宫颈癌妇女的优势表达基因；而祖菲娅·艾力等[12]则认为HLA-DQB1*03可能是喀什维吾尔族妇女宫颈癌的保护基因，HLA-DQB1*06可能是喀什维吾尔族妇女宫颈癌的易感基因；Chan等[17]在对我国南方地区宫颈癌妇女的研究结果显示，HLA-DQB1*03对HPV16阳性的宫颈癌有保护作用。研究结果的不一致可能是因为不同地区和民族的HLA分布不一致，又或者是由于研究对象选择的标准及检测方法等因素的差异造成的。

本次研究收集的样本集中在近期广西地区确诊的壮族宫颈癌患者(年龄25～45岁)，两组成员按年龄、地域及生活习惯进行频数匹配，这在一定程度上排除了年龄、地域、民族、生活习惯这些混杂因素对实验结果的影响。研究结果显示,等位基因HLA-DQB1*04/06/09的携带率在广西壮族女性宫颈癌患者组与无癌对照组的比较,经统计学处理两组间差异有统计学意义(P<0.05)；HLA-DQB1*04基因在宫颈癌患者组的携带率高于无癌对照组(P<0.05)，表明HLA-DQB1*04可能是广西壮族女性宫颈癌发生的易感基因， HLA-DQB1*06/09基因在宫颈癌患者组中的携带率低于无癌对照组(P<0.05)，提示HLA-DQB1*06/09可能是广西壮族女性宫颈癌的保护基因。最近的一项Meta分析显示[18]，HLA-DQB1*05/0301/0402则为宫颈癌的风险基因，而HLA-DQB1*02/03/0603与减少癌症风险有显著关联，我们的研究结果与之相似， 但HLA-DQB1*02/05/07/08在两组间的携带率并未发现有显著性差异(P>0.05)，表明这些等位基因可能与广西壮族女性宫颈癌遗传易感性无关。

高危性HPV持续感染及宿主遗传背景在宫颈癌发生发展中扮演同样重要的角色。研究显示HLA-DQB1基因多态性与HPV感染和宫颈癌的风险密切相关[19]。本研究按照HPV感染的情况，将宫颈癌患者分为HPV16型阳性组和HPV16型阴性组，等位基因HLA-DQB1*04出现的频率在HPV16阳性组与HPV16阴性组比较,经统计学处理两组间差异有统计学意义(P<0.05)，即等位基因HLA-DQB1*04在HPV16阳性者中出现的频率34.1%明显高于HPV16阴性者的8.1%(P=0.000)，说明携带HLA-DQB1*04等位基因的广西壮族妇女可能更容易感染HPV16型病毒，与新疆地区的一项研究结果相同[20]。考虑其原因可能是携带HLA-DQB1*04等位基因的妇女对HPV16型的易感性增加，特异的等位基因可能影响机体对HPV16型病毒的清除或免疫应答，也影响着宫颈癌的发生[12]。

综上所述，HLA-DQB1*04等位基因可能是广西壮族女性宫颈癌发生的易感基因，HLA-DQB1*06/09等位基因可能是广西壮族女性宫颈癌的保护基因。而HLA-DQB1*02/05/07/08等位基因可能与广西壮族女性宫颈癌遗传易感性无关。携带HLA-DQB1*04基因的广西壮族妇女可能更容易感染HPV16型病毒，从而增加了其患宫颈癌的危险性。本研究在一定程度上说明了HLA-DQB1等位基因多态性与广西地区壮族女性HPV16感染和宫颈癌发病的相关性，对高危型HPV16病毒携带者进行HLA-DQ基因的普查，对宫颈癌的早期发现和防治，降低宫颈癌的死亡率有一定意义[21]。由于目前受研究方法、研究对象以及样本量的选择等方面的影响，使本研究存在一定局限性，期望在今后的研究中鉴定和筛选出更多有价值的宫颈癌的易感基因和保护基因，从而可为针对高危人群的检测或是针对HPV感染的疫苗的开发与研制提供一定的理论依据。

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[收稿2016-08-29 修回2016-11-08]

(编辑 张晓舟)

Relationship between HLA-DQB1 allele polymorphism with HPV16 infection and cervical cancer susceptibility in Guangxi Zhuang women

LUTing-Ting,LIANGHui-Ping,XIONGHao,ZHUHua.

GuangxiMedicalCollege,Nanning530021,China

Objective:To study the relationship of Guangxi Zhuang women being infected by HPV16 and suffering from cervical cancer with HLA-DQB1 allele polymorphism.Provide clues for seeking hereditary susceptibility gene or resistant gene of cervical cancer of Guangxi Zhuang women.Methods：Chose the cervical cancer diagnosed female patients and health women 171 cases respectively aged between 25 and 45 of Guangxi as subject investigated(people in the two groups were paired by age ±3 years).Took their samples to extract HPV DNA and human genome DNA.Then detected HLA-DQB1 alleles and HPV genetype applying PCR-SSP and molecular diversion hybrid technology.Finally the data were statistically analyzed.Results：(1)The total infection rate of HPV in 171 cases of cervical cancer patient was 91.22%,in which the high-risk virus accounted for 90.76%,HPV16 was the main pathogenic subtypes(43.58%).(2)The allele carrying rate of HLA-DQB1*04 in the cervical cancer group was higher than the health control group with statistically significant difference(P<0.05).The allele carrying rate of HLA-DQB1*06/09 in the cervical cancer group was lower than the health control group with statistically significant difference(P<0.05).There was no significant difference of the allele carrying rate of HLA-DQB1*02/05/07/08 between two groups(P>0.05).(3)The occurrence frequency of HLA-DQB1*04 alleles in HPV16 positive cervical cancer patients was significantly higher than HPV16 negative patients with statistically significant difference(P<0.05).Conclusion：HLA-DQB1*04 alleles are probably the susceptibility genes of cervical cancer of Guangxi Zhuang women；HLA-DQB1*06/09 alleles are probably the protective genes of cervical cancer of Guangxi zhuang women； HLA-DQB1*02/05/07/08 alleles seem irrelevant to hereditary susceptibility of cervical cancer of Guangxi Zhuang women.And Guangxi Zhuang women carried HLA-DQB1*04 alleles are more likely to infect HPV16 that increase the risk of cervical cancer.

HLA-DQB1；Cervical cancer；Hereditary susceptibility gene

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.024

卢庭婷(1979年-),女，硕士,讲师,主要从事微生物学、生物化学与分子生物学研究。

及指导教师：梁惠萍(1978年-),女,硕士，副教授,主要从事肿瘤遗传学和遗传免疫学方面的研究。

R392.11

A

1000-484X(2017)04-0593-05

①本文为广西壮族自治区教育厅2016年度广西高校中青年教师基础能力提升项目(No.KY2016YB740)和广西壮族自治区教育厅项目(No.GXGZJG2015B240)。