应用rmIL-18诱导肿瘤特异性CTL治疗肝癌的实验研究①

米旭光 刘 磊 李首庆 魏海峰 许淑芬 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院肿瘤综合治疗科，长春130021)

·生物治疗·

应用rmIL-18诱导肿瘤特异性CTL治疗肝癌的实验研究①

米旭光 刘 磊 李首庆 魏海峰 许淑芬 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院肿瘤综合治疗科，长春130021)

目的：研究rmIL-18在体外培养系统(Coculture system in vitro，CCs)诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)及在小鼠体内发挥的抗肝癌效果。方法：采用Stem SepTM免疫磁性细胞分离方法分离培养小鼠脾脏NK细胞、T细胞及DCs，建立体外培养系统；采用不同途径，不同剂量CTL免疫肝细胞癌荷瘤小鼠，研究CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度和生存时间的影响。结果：rmIL-18能够在体外培养系统中诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应；CTL能够明显抑制荷肝癌小鼠的肿瘤生长速度(P<0.01)及明显延长荷瘤小鼠生存时间(P<0.01)，并且这种作用随rmIL-18浓度的增加而增强(P<0.01)，且肿瘤内注射均优于腹腔内注射(P<0.01)。结论：rmIL-18可以在体外诱导肿瘤特异性CTL并在小鼠体内发挥抗肝癌作用。

体外培养系统；rmIL-18；细胞毒性T淋巴细胞；抗肿瘤

肝癌是一种发病率高、恶性度高、预后较差、严重危害生命的恶性肿瘤，在我国恶性肿瘤的发病率中，男性居第三位，女性居第四位。采用手术、放疗、化疗等综合治疗措施后，肝癌仍居恶性肿瘤死亡率的第一位[1]。近年来，免疫治疗愈来愈受到人们的重视，并且已用于各种肿瘤的实验研究和临床治疗。IL-18具有增强免疫、抗肿瘤、抗感染等重要作用，在肿瘤的生物治疗中表现出了广泛的应用前景[2,3]。本实验研究重组鼠白细胞介素18(recombinant mouse interleukin-18，rmIL-18)在体外培养系统诱导的肿瘤特异性CTL作用和在小鼠体内发挥的抗肝癌作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 H22细胞株为BALB/c小鼠肝细胞癌，由本室经小鼠腹腔传代培养。

1.1.2 实验动物 BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，20～25 g，购自生物制品研究所动物部。

1.1.3 试剂 ①小鼠T细胞富集混合单克隆抗体，含抗CD11b CMac-1、抗CD45R(B220)、抗髓样分化抗原(Gr-1)、抗红细胞样细胞(TER119)，0.2 ml可标记1×109细胞；②小鼠NK细胞富集混合单克隆抗体，含抗红细胞样细胞(TER119)、抗CD22、抗F4/80、抗CD5ccy-1、抗髓样分化抗原(Gr-1)，0.2 ml可标记1×109细胞；③小鼠树突状细胞富集混合单克隆抗体，含抗CD2、抗CD3、抗CD45R(B220)、抗髓样分化抗原(Gr-1)、抗中性粒细胞抗原(7/4)、抗红细胞样抗原(TER119)，0.2 ml可标记1×109细胞。均购于StemCell Technologies，美国。重组细胞因子 rmIL-18 本实验室制备。抗小鼠IFN-γ单抗购于长春博特生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾脏纯化NK、DCs和T细胞的制备 采用Stem SepTM免疫磁性细胞分离方法分离培养小鼠脾脏NK细胞、T细胞及DCs。

1.2.1.1 小鼠脾脏单核细胞悬液的制备 无菌条件下取出小鼠脾脏，以200目细胞网分离小鼠脾细胞，制备单核细胞悬液，溶解红细胞，以无血清IMDM培养基洗涤3次，调整细胞浓度至1×108个/ml，以10% FCS IMDM培养液培养备用。

1.2.1.2 分离小鼠脾脏DCs 取含1×109小鼠脾细胞悬液9 ml(含1 mmol/L EDTA无钙镁PBS)，加入Stem SepTM小鼠DCs富集混合抗体1 ml。充分混合后，37℃ 5%CO2培养30 min，PBS洗涤3次，再加入四抗体磁珠混合物，37℃ 5%CO2培养30 min，过无菌磁性筛柱，收集未标记的目的细胞，PBS洗涤3次。细胞加入含10 ng/ml GM-CSF、10% FCS的IMDM培养液，培养备用。

1.2.1.3 分离小鼠脾脏NK细胞 取含1×109小鼠脾细胞悬液9 ml(含1 mmol/L EDTA无钙镁PBS)，加入Stem SepTM小鼠NK细胞富集混合抗体1 ml。充分混合后，洗涤与磁性分离如1.2.1.2。收集的细胞加入10%FCS的IMDM培养液，培养备用。

1.2.2 建立体外培养系统 实验前，将分离纯化的小鼠脾脏NK细胞、T细胞及DCs按一定的细胞比例加入培养系统，其中NK细胞为16.5%、T细胞为82.7%、DCs为0.8%。

1.2.3 CTL杀伤实验 为观察rmIL-18在CCs中诱导肿瘤特异性CTL的能力，将丝裂霉素(MMC 100 μg/ml)处理1 h的H22细胞按2%的比例加入CCs，再加入不同浓度的rmIL-18(0、10、50、100 ng/ml)，37℃ 5%CO2培养96 h后收集细胞，以不同的效靶比(1∶6.25、1∶12.5、1∶25、1∶50)分别检测对125I-UdR标记的H22细胞的特异性杀伤能力。

1.2.4 小鼠肝细胞癌实验动物模型的建立 将生长良好、源于BALB/c小鼠的肝癌细胞H22经PBS洗涤3次，分别取5×105、1×106、2×106个细胞溶于100 μl生理盐水中，接种于3组BALB/c小鼠右肋部皮下(day 0)，作为皮下接种肝癌的实验动物模型。确定建立肝细胞癌荷瘤小鼠的合适H22细胞浓度。

1.2.5 应用肿瘤特异性CTL免疫荷瘤小鼠 采用不同途径，不同剂量rmIL-18免疫肝细胞癌荷瘤小鼠，研究肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度和生存时间的影响。实验动物肿瘤直径的测量方法(皮下荷瘤模型)：肿瘤直径(mm)=(肿瘤最长直径+肿瘤最短直径)/2。

1.3 统计学方法 两组显著性差异用t检验，生存率用Kaplan-Meier乘积限法估计。

2 结果

2.1 rmIL-18在CCs中诱导肿瘤特异性CTL 以不同浓度的rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL以不同的效靶比(1∶6.25、1∶12.5、1∶25、1∶50)分别检测对125I-UdR标记的H22细胞的特异性杀伤能力。结果表明(图1)，在CCs中，rmIL-18能够促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应，这种杀伤作用与rmIL-18的含量呈剂量依赖关系，即随rmIL-18的浓度增高而增加。

2.2 在CCs中IFN-γ对rmIL-18诱导肿瘤特异性CTL的影响 我们观察了IFN-γ在CCs中对rmIL-18诱导肿瘤特异性CTL的影响，在肿瘤抗原刺激的CCs中，加入不同浓度的rmIL-18，再加入抗IFN-γ单抗(5 μg/ml)，培养96 h，以50∶1的效靶比检测IFN-γ对rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生的影响，结果表明(图2)，加入抗IFN-γ单抗及对照单抗均对rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程无明显影响，证明rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL的过程与IFN-γ的产生无关。

图1 在体外培养系统中rmIL-18诱导的H22特异性CTL杀伤活性Fig.1 Effect of rmIL-18 on induction of tumor-specific CTL activity in coculture system

图2 抗IFN-γ抗体对rmIL-18诱导H22特异性CTL的影响(E∶T=50∶1)Fig.2 Effect of anti-IFN-γ on rmIL-18 induced H22 tumor-specific CTL activity in coculture system(E∶T=50∶1)

图3 不同途径应用肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度的影响Fig.3 Tumor diameters of mice after administration tumor-specific CTLs with different routes

2.3 不同途径输入肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度和生存时间的影响 将30只荷瘤小鼠随机分成3组，分别在接种肿瘤后第10天开始，经肿瘤内或腹腔内输入肿瘤特异性CTL，1×106100 μl/只，对照组经腹腔输入生理盐水，100 μl/只，隔1 d注射1次，共计10次。每周测量荷瘤小鼠肿瘤直径，以观察经不同途径输入肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度的影响(图3)。结果表明，无论是经腹腔或经肿瘤内输入肿瘤特异性CTL，均能明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长速度(P<0.01)，但经肿瘤内输入肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用明显高于经腹腔输入组(P<0.01)。进一步观察不同途径应用肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠生存时间的影响(图4)。结果表明，不同途径

图4 不同途径应用肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠生存时间的影响Fig.4 Survival of mice inoculated into flanks with H22 cells after immunotherapy with tumor-specific CTLs with different routes

图5 不同剂量肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度的影响Fig.5 Tumor diameters of mice after administration tumor-specific CTLs with different dosage

应用肿瘤特异性CTL均能延长荷瘤小鼠的生存时间(P<0.01)，对照组小鼠在45 d全部死亡。观察60 d，应用肿瘤特异性CTL治疗的荷瘤小鼠有半数以上存活，两者无差异。

2.4 不同剂量肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度的影响 将30只皮下接种1×106100 μl H22细胞的BALB/c小鼠随机分成3组，分别在接种肿瘤后第10天开始腹腔内输入rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL或生理盐水(1×106/100 μl/只，1×107/100 μl/只，生理盐水100 μl/只)，隔1 d输入1次，共计10次。每周测量荷瘤小鼠肿瘤直径，以观察rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL对荷瘤小鼠肿瘤生长速度的影响(图5)。结果表明，与对照组相比，腹腔内输入rmIL-18诱导的肿瘤特异性CTL能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长速度(P<0.01)，并且随输入CTL的数量增多，这种抑制作用明显增强(P<0.01)。

3 讨论

肝癌严重威胁生命，虽然早期诊治水平不断提高，但预后仍然很差。随着肿瘤生物治疗的迅速发展，癌症的免疫治疗法已被认为是继手术、放疗、化疗之后第四种疗法。肿瘤的细胞因子治疗是免疫治疗的重要策略之一，越来越受到重视，已经是研究重点和临床应用的典型疗法[4]。

IL-18的抗肿瘤效应初期是由NK细胞介导的，IL-18是通过增强NK细胞的活性来表现其抗肿瘤效果的[5]。有研究发现经IL-18预处理过的荷瘤鼠均可存活，表明IL-18在体内有很强的抗肿瘤活性，且IL-18能相继诱导NK细胞和CTL细胞的抗肿瘤作用[6，7]。IL-18处理后的荷瘤小鼠表现出免疫记忆功能，对再接种的肿瘤会有明显的抵抗作用，这种抵抗作用是由细胞毒性CD4+细胞完成的[8]。IL-18亦可以诱导CTL细胞的产生，促进其成熟和增殖，有效杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤效果[9，10]。

在本实验室以往的研究中，证实了IL-18首先通过增加NK细胞的活性作用，诱导快速有效的肿瘤杀伤作用，继之使DCs成为有效的抗原提呈细胞,然后，引起强的由CD4+CTL 和CD8+CTL介导的特异性的抗肿瘤免疫反应[11-13]。在本文中我们应用rmIL-18和小鼠脾细胞纯化的NK细胞、树突状细胞、T细胞结合的体外培养系统，在包括2‰经丝裂霉素处理的肿瘤细胞存在的情况下，培养96 h后，成功的诱导出肿瘤特异性CTL，建立了一种在体外快速有效的扩增肿瘤特异性CTL方法。随后，我们观察了在CCs中诱导出的H22特异性CTL在体内的抗肿瘤作用。经肿瘤内或腹腔内输入肿瘤特异性CTL均能够明显抑制荷肝癌小鼠的肿瘤生长速度(P<0.01)及明显延长荷瘤小鼠生存时间(P<0.01)，并且这种作用随CTL细胞数量的增加而增强(P<0.01)。但肿瘤内输入肿瘤特异性CTL抑制荷瘤小瘤的肿瘤生长速度优于腹腔内输入，并且随输入CTL的数量增多，这种抑制作用明显增强，此与CTL杀伤肿瘤细胞方式有关，而在延长荷瘤小鼠的生存时间方面两者并无统计学意义差异。

综上所述，通过IL-18在CCs中诱导的肿瘤特异性CTL均可以起到良好的杀伤肿瘤细胞的作用，本研究为肿瘤细胞因子免疫疗法提供了实验依据和研究方向。

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[收稿2016-01-04]

(编辑 许四平)

Experimental study of tumor-specific CTL induced by rmIL-18 treated on hepatocellular carcinoma

MIXu-Guang,LIULei，LIShou-Qing,WEIHai-Feng,XUShu-Fen,TANYan,FANGYan-Qiu.

JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To research rmIL-18 in vitro culture system CCs induce tumor-specific cytotoxic T lymphocytes CTL and anti-tumor effect in mice.Methods：Used Stem SepTMimmune magnetic cells separation method to culture mouse spleen NK cells,T cells and DCs,established culture systems in vitro;used of different approaches,different doses rmIL-18 to immunize HCC tumor-bearing mice,researched the effect of rmIL-18 on tumor growth rate and survival time.Results：rmIL-18 could induce and promote tumor-specific CTL-mediated killing effects in vitro culture system;tumor-specific CTL could significantly inhibit tumor growth(P<0.01) of and prolong the survival time of liver cancer tumor-bearing mice(P<0.01),and the effect was increased with rmIL-18 concentration increased(P<0.01),and intratumoral injection was superior to intraperitoneal injection(P<0.01).Conclusion：rmIL-18 can induce tumor-specific CTL in vitro and play a role in anti-liver cancer in mice.

CCs;rmIL-18;CTL;Anti-tumor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.014

①本文受吉林省科技发展计划项目(20140519018JH)、吉林省人社厅省人才开发基金(2016年度)和吉林省科技厅重点实验室项目(20122113)资助。

米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究员，主要从事肿瘤靶向治疗的科研工作，E-mail:mixg699@163.com。

及指导教师：方艳秋(1968年-)，女，博士，教授，主要从事肿瘤免疫治疗相关研究，E-mail:yq.fang@163.com。

R735.7

A

1000-484X(2017)04-0545-04