PSMA7对A549细胞中RB途径的影响①

黄 湘 钟裕恒 谭家余 吴学威 梁 睿 梁少霞 赵 婧

(南方医科大学附属中山博爱医院产前诊断中心,中山528403)

PSMA7对A549细胞中RB途径的影响①

黄 湘 钟裕恒 谭家余②③吴学威 梁 睿 梁少霞 赵 婧

(南方医科大学附属中山博爱医院产前诊断中心,中山528403)

目的：探究高表达和干扰PSMA7对A549细胞周期以及RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响。方法：将pcDNA3.1-PSMA7高表达和pGPU6/Hygro-PSMA7-265干扰载体分别瞬时转染A549细胞，然后用流式细胞仪检测PSMA7对细胞周期的影响，再通过Western blot 实验检测Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平。结果：和对照组相比，PSMA7高表达时周期时相分布无明显差异，但Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平明显降低，P16、Rb的表达明显增高；和对照组相比，干扰PSMA7后细胞的G0/G1、G2/M期比例均降低，而S期的值增高，均具有差异，而Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平明显增加，P16、Rb的表达明显降低，以上结果与对照组相比差异均有统计学意义。结论：PSMA7在A549肺腺癌细胞中能够影响RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平的表达，干扰PSMA7使A549细胞较早进入S期。

HSPC238;RB途径;细胞周期;免疫印迹

PSMA7基因编码人类蛋白酶体α7亚基(Proteasome subunit，alpha type 7，PSMA7)，该蛋白是20S蛋白酶体核心复合体的一个α亚基，它参与HBV、HCV和HIV病毒的复制及多种蛋白质的降解[1-3]，并与HIF-1、c-Abl及Arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用[4，5]，但与肿瘤的相关性仍知之甚少。我们的前期研究显示PSMA7可抑制A549细胞的增殖能力和成瘤性[6]，但具体机制不清楚。RB途径主要包括Cyclin D1、CDK4、P16、Rb等蛋白，与细胞的增殖存在密切关系。PSMA7抑制肿瘤的作用是否通过RB途径起作用，还不得而知。本研究通过过表达和敲除A549细胞中的PSMA7，观察其对A549细胞周期以及对Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响，探讨PSMA7抑制A549细胞增殖和成瘤性的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 肺腺癌细胞株A549由本实验室保存；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；RPMI1640粉及新生牛血清均购自Gibco BRL公司；pcDNA3.1和pcDNA3.1-PSMA7由本实验室保存和构建；pGPU6/Hygro-PSMA7-265和pGPU6/Hygro-SHNC质粒购于GenePharma公司；PSMA7、Cyclin D1、CDK4、P16和Rb抗体和相应二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；碘化丙啶(PI)购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞在含10%新生牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养。

1.2.2 质粒转染 将处于对数生长期的A549细胞重悬于完全培养基中，以3×105细胞/孔接种于6孔板中，培养24 h，使细胞达到80%～90%融合。按照LipofectamineTM2000说明书，将上述质粒通过脂质体法导入A549细胞系中。

1.2.3 Western blot实验 0.25%胰酶分别消化转染质粒细胞并提取其总蛋白，用分光光度计进行蛋白定量，以GAPDH为内参。分别取50 μg细胞总蛋白电泳，然后将电泳后的蛋白转印至PVDF膜上，加相应一抗(1∶500)反应1.5 h,最后加入用辣根过氧化物酶标记的二抗，发光显色。实验重复3次。

1.2.4 将转染了PSMA7高表达质粒、干扰质粒和对照质粒的细胞按4×105个/孔细胞数接种于6孔板，在合适条件下的孵箱中培养至80%以上的细胞融合度，加入1640培养基继续培养24 h。用0.25%胰酶消化细胞后收集12 000个上机，DNA周期分析用美国PHEONIX公司的MULTYCYCLE软件，最后计算出细胞各期的百分数。

2 结果

2.1 PSMA7的表达 如图1和表1，与A549/pcDNA3.1细胞(0.732±0.058)相比，A549/pcDN-A3.1-PSMA7细胞(1.690±0.101)中的PSMA7表达量明显增加(P<0.05)。如图1和表2，与转染shNC细胞(0.765±0.077)相比，转染shPSMA7细胞(0.287±0.058)的PSMA7表达量明显减少(P<0.05)。

2.2 PSMA7对RB途径的影响 如图2、3，瞬时转染A549细胞后采用Western blot法分别检测Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白的表达水平，结果发现：PSMA7高表达时使Cyclin D1、CDK4的表达明显降低，P16和Rb的表达明显增高；PSMA7干扰时使Cyclin D1和CDK4的表达明显增加，P16和Rb的表达明显降低。

2.3 PSMA7对A549细胞生长周期的影响 使用流式细胞仪检测发现，与A549/pcDNA3.1(-)组对比，A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7组的细胞周期时相分布差异无统计学意义(P均>0.05)，见图4、表3。和shNC细胞组对比，shPSMA7细胞组的G0/G1、G2/M期细胞比例都降低，而S期的比例较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。 表明干扰PSMA7后，A549细胞提早进入S期(图5，表4)。

图1 Western blot法检测敲低或者过表达PSMA7后的蛋白表达量Fig.1 Detection of protein level of downregulated or upregulated PSMA7 by Western blotNote：1.shNC；2.shPSMA7；3.A549/pcDNA3.1；4.A549/pcDNA3.1-PSMA7.

GroupsnDensityratiotPA549/pcDNA3 1(-)30 732±0 058-14 2820 000A549/pcDNA3 1(-)/PSMA731 690±0 101

GroupsnDensityratiotPshNC30 765±0 0778 5990 001shPSMA730 287±0 058

图2 PSMA7对Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响(Western blot法)Fig.2 Effect of PSMA7 on protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb(Western blot)Note：1.shNC；2.shPSMA7；3.A549/pcDNA3.1；4.A549/pcDNA3.1-PSMA7.

图3 PSMA7对Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响Fig.3 Effect of PSMA7 on protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb

图4 PSMA7高表达组A549细胞周期的流式图Fig.4 Results of cell cycles after PSMA7 overexpress by flow cytometer

GroupsnG0/G1G2/MSA549/pcDNA3 1(-)351 73±1 428 20±0 2640 06±1 16A549/pcDNA3 1(-)/PSMA7353 63±3 977 73±0 2538 63±3 84t-0 7802 2140 619P0 4790 0910 569

3 讨论

PSMA7是20S蛋白酶体核心复合体的一个α亚基，参与组成泛素-蛋白酶体系统，目前，蛋白酶体抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的新热点，如环氧酮类药物卡非佐米、硼酸类药物硼替佐米和正在临床研究阶段的β-内酯类药物Marizomib[7-9]。研究20S蛋白酶体核心复合体的结构和功能，对于进一步开发蛋白酶体抑制剂，促进肿瘤疾病的防治具有重要意义。

我们前期研究发现，在肺腺癌中,癌组织胞浆中PSMA7蛋白的表达明显高于癌旁组织胞浆的表达[10]。通过体外实验发现PSMA7具有抑制A549肺腺癌细胞增殖和侵袭能力的作用，同时通过裸鼠成瘤实验发现其在体内具有抑制肺腺癌形成的作用[6]。另外，我们发现高表达PSMA7可引起A549细胞表面黏附分子ICAM-1和VCAM-1 表达量减少，反之，干扰PSMA7可引起ICAM-1和VCAM-1 表达量增加，提示其可能通过此途径参与肺腺癌细胞的侵袭和转移[11]，但PSMA7在肿瘤组织中发挥作用的具体机制还不清楚。

图5 干扰组A549细胞的细胞周期流式图Fig.5 Results of cell cycles after PSMA7 knocked out by flow cytometer

GroupsnG0/G1G2/MSshNC461 53±2 407 40±0 5831 10±2 08shPSMA7456 33±2 005 80±0 6737 93±1 47t-3 335-3 6085 353P0 0160 0110 002

本研究通过探讨PSMA7与RB途径的关系，发现干扰PSMA7使Cyclin D1和CDK4的表达明显增加，P16和Rb的表达明显降低；反之，PSMA7高表达时使Cyclin D1和CDK4的表达明显降低，P16和Rb的表达明显增高。提示PSMA7可能通过影响RB通路从而参与细胞周期G1/S期转换的过程。既往研究表明，Cyclin D1、CDK4、p16、pRb、E2F之间通过复杂的反馈调节环路[12]，调控着细胞G1/S期转换。Cyclin D1的激活是细胞周期调控系统的始动环节，CDK4的活性受Cyclin D1的正向调控，而p16可以通过与Cyclin D1竞争CDK4参与其负向调控。最终CDK4通过影响Rb蛋白磷酸化状态调控E2F的转录活性，从而调控着细胞G1/S期转换。

由于Cyclin D1是通过泛素-蛋白酶体途径降解的[13]，PSMA7是20S蛋白酶体核心复合体的一个重要的α亚基，而我们的研究发现和对照组相比，PSMA7高表达时周期时相分布无明显差异，但Cyclin D1和CDK4的蛋白表达水平明显降低，P16和Rb的表达明显增高；与对照组相比，干扰PSMA7后细胞的G0/G1、G2/M期比例均降低，而S期的比例高，均具有差异，而Cyclin D1和CDK4的蛋白表达水平明显增加，P16和Rb的表达明显降低。PSMA7高表达时周期时相分布无明显差异可能是由于启动了负反馈机制造成的。由以上结果我们猜测，PSMA7很可能通过影响Cyclin D1的降解从而参与调控RB途径从而影响细胞周期。另外，有报道发现PSMA7可以与HIF-1α结合并抑制其转录[14]，而在A549细胞中，HIF-1α可以调节Cyclin D1[15]，故我们推测PSMA7也可能通过调节HIF-1α从而影响Cyclin D1，进而影响RB途径中的其他周期蛋白的水平。不过，Cyclin D1、CDK4、p16、pRb、E2F之间有着复杂的反馈调节环路，PSMA7影响RB途径的具体机制还有待探索。我们目前正进一步实验以验证这些猜想。

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[收稿2016-03-31 修回2016-07-14]

(编辑 张晓舟)

Effect of PSMA7 on RB pathway in A549 cells

HUANGXiang,ZHONGYu-Heng,TANJia-Yu,XUXue-Wei,LIANGRui,LIANGShao-Xia,ZHAOJing.

PrenatalDiagnosisCenter，BoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Zhongshan528403,China

Objective:To investigate the effect of upregulated and downregulated PSMA7 on the cell cycle and Cyclin D1，CDK4，P16，Rb of RB pathway in A549 cells.Methods：Transfected upregulated pcDNA3.1-PSMA7 vecter and downregulated pGPU6/Hygro-PSMA7-265 vecter into A549 cells,and then tested the effect of PSMA7 on the cell cycle of A549 cells by flow cytometry,and detected the protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb by Western blot.Results：Compared with the control group,the cell cycle of the A549 cells did not change significantly,and the expression of Cyclin D1，CDK4 decreased but P16，Rb increased when PSMA7 was upregulated.Compared with the control group,the proportion of phase G0/G1,G2/M of the A549 cells decreased and phase S increased,and the expression of Cyclin D1，CDK4 increased but P16，Rb decreased when PSMA7 was downregulated.There was statistical significance for those results.Conclusion：PSMA7 could affect the expression of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb protein level of RB pathway in A549 and promoted the A549 cells into phase S when it′s downregulated.

HSPC238;RB pathway;Cell cycle;Western blot

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.008

①本文受广东省医学科研基金项目(A2013875)和国家自然科学基金 (81101534) 资助。

黄 湘(1971年-)，女，博士，主任技师，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫及产前诊断研究，E-mail:340382761@qq.com。

R34

A

1000-484X(2017)04-0516-04

②南方医科大学附属中山博爱医院中心ICU,中山528403。

③通讯作者,E-mail:28242174@qq.com。