γδT17/Th17/Tc17细胞在H1N1重症感染小鼠肺脏中的分布及其与肺脏免疫损伤的关系①

薛春雪 温铭杰 刘 萌 张须龙 曹 彬

(首都医科大学附属北京朝阳医院,北京100020)

·临床免疫学·

γδT17/Th17/Tc17细胞在H1N1重症感染小鼠肺脏中的分布及其与肺脏免疫损伤的关系①

薛春雪 温铭杰②刘 萌③张须龙②曹 彬④

(首都医科大学附属北京朝阳医院,北京100020)

目的：探讨γδT17/Th17/Tc17细胞在H1N1重症感染小鼠肺脏中的分布及其与肺组织炎性损伤的关系。方法：通过滴鼻感染建立H1N1重症感染小鼠模型；采用流式细胞术检测小鼠肺组织中γδT17/Th17/Tc17细胞的比例和数目；采用ELISA和Luminex多因子试剂盒检测肺泡灌洗液(BALF)中IL-17A、IL-1β、IL-23的浓度和血清中IL-17A 的浓度。结果：①建立了H1N1重症感染小鼠模型；②感染后第3天小鼠肺脏中γδT细胞占总淋巴细胞的比例较对照组显著升高(P<0.01)，而Th和Tc细胞的比例较对照组无明显差异；③感染后第1天肺脏中γδT17细胞占总γδT细胞的比例和数目较对照组显著升高(P<0.05)；Th17和Tc17细胞占Th和Tc细胞的比例和数目较对照组也升高；其中γδT17细胞的数目显著高于Th17和Tc17细胞(P<0.05)；④感染后小鼠BALF中IL-17A的浓度逐渐升高，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)；感染后第3天血清中IL-17A也显著升高(P<0.05)；BALF中可能参与γδT17细胞活化的IL-1β和IL-23的浓度较对照组显著升高。结论：γδT17细胞有可能以γδTCR非依赖的作用方式活化，并通过释放IL-17A参与H1N1重症感染小鼠早期肺组织炎性损伤过程。

γδT细胞;H1N1;重症流感;IL-17A

新型甲型H1N1流感病毒有很高的致病性，通常患者多表现为轻症，与普通流感相似；但部分重症患者病情进展迅速，临床表现为急性呼吸窘迫综合征、呼吸衰竭和多器官功能衰竭等并发症甚至死亡，严重威胁人类的健康[1]。尸检病理检查结果发现：肺脏组织内弥漫性肺泡损伤，肺间质、细支气管壁等大量炎性细胞浸润[2]。研究表明：细胞因子风暴是H1N1重症感染乃至患者死亡的重要原因[3,4]，其中IL-17A是一类重要的促炎因子，能够募集活化多种免疫细胞参与炎症反应，对包括肺脏在内的多种靶器官产生免疫病理损伤[5]。目前已知产生IL-17A的适应性免疫细胞主要包括CD4+Th17细胞和CD8+Tc17细胞[6-8]；产生IL-17A的固有样淋巴细胞主要包括γδT细胞和NKT细胞，其中γδT细胞产生IL-17A的数量甚至超过Th17细胞[9-11]。本课题组前期研究发现H1N1重症感染小鼠：①肺组织中γδT细胞比例和数目明显增多；②经IL-17A中和抗体干预后，其肺组织损伤减轻，存活期延长[12]。据此，课题组对H1N1重症感染小鼠肺组织中可能产生IL-17A 的T细胞，即γδT17细胞，CD4+Th17细胞和CD8+Tc17细胞的比例、数目及其产生IL-17A 的动态变化，以及肺组织中可能参与γδT17细胞活化的细胞因子及其浓度进行了检测。现将初步研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级BALB/c小鼠，雌性，4～6周龄，体重14～16 g；新型甲型H1N1流感病毒(A/California/07/2009)均由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 H1N1重症感染小鼠模型的建立 BALB/c小鼠随机分为模型组和正常对照组。模型组小鼠麻醉后取106TCID50/ml H1N1病毒液50 μl滴鼻感染；正常对照组小鼠用等量磷酸盐缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)滴鼻。每日观察并记录小鼠体征、体重变化及其生存率。

1.2.2 血清、支气管肺泡灌洗液和肺脏的收集 小鼠麻醉后摘除眼球取血，室温30 min凝固后1 500 r/min 4℃离心5 min，收集血清-80℃冻存备用。BALF制备如下：① 小鼠腹部向上固定四肢，用75%乙醇消毒后分离颈部皮肤肌肉，行气管切开和导管插入；② 取预冷PBS 1 ml 经导管注入小鼠支气管肺泡，灌洗2次后回收灌洗液；③1 500 r/min 4℃离心5 min，收集上清液-80℃冻存备用。开胸取小鼠完整肺脏置于平皿中，用PBS 清洗后取左肺制备石蜡切片用于HE染色，取右肺制备细胞悬液用于流式细胞检测。

1.2.3 肺组织切片制备和HE染色 取小鼠左肺同一部位组织切块，将其用10%多聚甲醛固定24 h后石蜡包埋，制备4 μm组织切片，经脱蜡、梯度水化后进行HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.2.4 肺组织单个核细胞悬液的制备 方法简述如下：①将剪切成1 mm3碎块的右肺组织置于含有0.1%胶原酶Ⅰ的DMEM消化液中，在37℃恒温摇床(200 r/min)消化60 min后，轻轻吹打收集含分散细胞的消化液；②经200目不锈钢丝网过滤，1 260 r/min离心15 min，弃上清；③用40% Percoll溶液重新悬浮细胞沉淀，将上述细胞悬液轻轻置于70% Percoll溶液上，室温1 260 r/min离心30 min(升速6，降速2)；④收集白膜层细胞，用PBS洗涤2次后加入适量PBS制成单个核细胞悬液。

1.2.5 γδT17/Th17/Tc17细胞的检测 ①将上述单个核细胞数量调整为2.0×106个/管； ②加入Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlugTM(BD Phar mingen)于37℃ 5%CO2培养箱中孵育刺激4 h；③加入抗Fc受体抗体(BD Phar mingen)冰上避光孵育10 min；④ 根据实验所需加入以下荧光标记抗体：anti-CD3-BV510、anti-CD3-APC-Cy7、anti-CD4-PE、anti-CD8a-PerCP-Cy5.5(BD Phar mingen)，anti-TCRβ-PE-Cy7(eBioscience)，anti-TCRγ/δ-APC(Biol-egend)进行胞外染色，冰上避光孵育30 min，PBS洗涤2次；⑤采用BD Cytofix/CytopermTM(BD Phar mingen)固定剂和破膜剂处理后，加入anti-IL-17A-PE-Cy7(eBioscience)进行胞内染色，冰上避光孵育30 min，PBS洗涤2次后加入300 μl PBS重悬细胞，BD FACSCantoⅡ流式细胞仪检测。

1.2.6 BALF 和血清中IL-17A、IL-1β和IL-23浓度的检测 按照IL-17A ELISA试剂盒(Abcam)说明书，检测BALF和血清中IL-17A的浓度；按照Luminex多因子检测试剂盒(Bio-Rad)说明书，检测BALF中IL-1β和IL-23的浓度。

2 结果

2.1 H1N1重症感染小鼠模型的建立 用106TCID50/ml H1N1流感病毒液50 μl滴鼻感染，小鼠出现竖毛、精神萎靡、食欲减退等症状；体重逐日减轻，在感染第5天体重下降26.31%(图1A)，感染第7天小鼠全部死亡(图1B)。取正常对照组小鼠和感染后第1、2、3、5、7天小鼠肺组织制备石蜡切片，HE染色发现：正常对照组小鼠肺泡结构正常，无炎性细胞浸润；感染小鼠肺组织可见支气管、血管周围大量炎症细胞浸润，支气管腔内充血，肺泡上皮细胞脱落、坏死，肺泡腔塌陷。上述肺组织损伤严重程度随时间进展逐渐加重，并出现病灶扩大、融合等病理改变(图1C)。上述所见表明，H1N1重症感染小鼠模型成功建立。

2.2 感染后不同时间点γδT/CD4+Th/CD8+Tc细胞在肺组织中的分布 取肺组织单个核细胞，采用流式细胞术检测γδT细胞占肺脏总淋巴细胞的比例及其动态变化，结果如图2A、B所示：感染后第3天小鼠γδT细胞的比例(1.10%)较正常对照组小鼠γδT细胞比例(0.49%)显著升高，具有统计学意义(P<0.01)。

采用流式细胞术检测肺组织中Th细胞和Tc细胞占总淋巴细胞的比例：本实验首先圈定淋巴细胞后分析αβT细胞占淋巴细胞比例(图3A1)，然后分析检测αβT细胞中CD4+Th细胞和CD8+Tc细胞的比例(图3A2)。 结果发现，感染后第3天小鼠CD4+Th细胞和CD8+Tc细胞占总淋巴细胞的比例(图3A1中αβT细胞比例与图3A2中CD4+T或CD8+T

细胞比例)分别为31.09%和12.56%(图3B、C)，与正常对照组小鼠CD4+Th/CD8+Tc细胞占总淋巴细胞的比例(36.97%、15.19%)无明显差异(P>0.05)。 感染后第1天和第7天小鼠肺脏CD4+Th/CD8+Tc细胞占总淋巴细胞的比例与感染后第3天小鼠大致相同(图3B、C)。上述结果表明，感染早期肺组织中以γδT细胞浸润为主，提示γδT细胞可能参与H1N1重症感染小鼠肺组织病理损伤过程。

2.3 感染后不同时间点γδT17/Th17/Tc17细胞在肺组织中的分布 采用流式细胞术检测肺组织中IL-17+T细胞，即γδT17/Th17/Tc17细胞的比例和数目，结果如图4所示：①感染后第1天γδT17细胞占总γδT细胞的比例(22.10%)和数目(6.15×103个/

图1 H1N1 流感病毒感染后小鼠体重、生存率和肺组织病理学变化Fig.1 Changes of body weight,survival rate and histopathology in mice lung tissue after H1N1 influenza virus infectionNote：A.Body weight change；B.Survival rate；C.Lung tissue HE staining showed at different DPI(days post infcetion,DPI)(n=6,×40,bar=100 μm).

图2 流感病毒感染不同时间肺组织中γδT细胞比例的动态变化Fig.2 Dynamic changes in proportion of γδT cells at different DPINote：A.Flow chart;B.Proportional statistics(n=3);**.P<0.01.

图3 流感病毒感染不同时间肺组织中CD4+Th/CD8+Tc细胞比例的动态变化Fig.3 Dynamic changes of proportion of CD4+Th/CD8+Tc cells at different DPINote：A1.Flow chart showed the proportion of αβT cells in total lymphocytes at different DPI;A2.Flow chart showed the proportion of CD4+Th/CD8+Tc cells in αβT cells;B.The histogram showed the percent of CD4+Th cells in lung lymphocytes(n=3);C.The histogram showed the percent of CD8+Tc cells in lung lymphocytes(n=3).

图4 流感病毒感染不同时间γδT17/Th17/Tc17细胞比例和数目的动态变化Fig.4 Dynamic changes of proportion and number of γδT17/Th17/Tc17 cells at different DPINote：A.Flow chart showed the proportion of γδT17,Th17 and Tc17 cells at different DPI;B.The histogram showed the percent of γδT17,Th17 and Tc17 cells at different DPI(n=3);C.The histogram showed the number of γδT17,Th17 and Tc17 cells at different DPI(n=3);*.P<0.05;**.P<0.01.

肺)较正常对照组小鼠γδT17细胞占总γδT细胞的比例(8.83%)和数目(3.0 ×103个/肺脏)显著升高，具有统计学意义(P<0.05)；②感染后第1天肺脏中γδT17细胞的数目(6.15×103)明显高于CD4+Th17细胞(1.35×103)和CD8+Tc17细胞(0.75×103)，具有统计学意义(P<0.05)；③感染组小鼠Th17/Tc17细胞占Th/Tc细胞的比例和数目较正常对照组均显著升高(图4A～C)，是因肺组织中γδT17细胞产生的IL-17A 对Th17/Tc17细胞具有趋化募集作用所致[13-15]。上述结果证实，H1N1重症感染小鼠肺组织中以γδT17细胞浸润为主，表明γδT17细胞参与H1N1重症感染小鼠肺组织病理损伤过程。

2.4 感染后BALF和血清中IL-17A浓度显著升高 采用ELISA法分别检测正常对照组和感染后1、3、7 d小鼠BALF中IL-17A浓度，结果如图5A所示：感染后小鼠BALF中IL-17A浓度随感染进程逐渐升高，第3、7天分别升高至4.96、5.49 pg/ml，与未感染对照组小鼠BALF中IL-17A浓度(1.52 pg/ml)相比存在显著性差异(P<0.05)。上述结果证实H1N1重症感染小鼠早期肺组织中IL-17A浓度显著升高，表明γδT17细胞可通过分泌IL-17A 参与肺组织病理损伤过程。

同时发现感染后第3天小鼠血清中IL-17A浓度(14.56 pg/ml)明显高于正常对照组小鼠血清IL-17A浓度(7.90 pg/ml)，具有统计学意义(P<0.05，图5B)。

2.5 BALF中与γδT17细胞活化相关的细胞因子浓度显著增高 γδT细胞的TCR缺少多样性，所识别的抗原种类有限。目前研究证实：γδT细胞可通过表面TCR直接识别结合某些病毒(单纯疱疹病毒、HIV病毒、EB病毒、巨细胞病毒)感染的靶细胞而被激活，并通过释放细胞毒性介质和促炎细胞因子发挥免疫作用[16-19]。但迄今为止尚未见到γδT细胞可被流感病毒感染靶细胞激活相关的研究报道。Ma等[20]关于IL-1β和IL-23协同作用可使肿瘤微环境中γδT17细胞活化的研究报道，提示γδT17细胞可能还存在一种γδTCR非依赖的活化途径。据此，采用Luminex多因子检测试剂盒对BALF中相关细胞因子进行检测，结果如图6所示：感染后第1、2、3天BALF中IL-1β浓度(420.33、210.21、170.64 pg/ml)和IL-23浓度(58.62、70.36、47.67 pg/ml)较对照组IL-1β浓度(87.76 pg/ml)、IL-23浓度(32.82 pg/ml)显著升高，具有统计学意义。上述结果表明，在感染后肺组织局部微环境中IL-1β和IL-23的协同作用下，γδT17细胞也有可能以一种γδTCR非依赖作用方式活化，并通过释放IL-17A参与肺组织病理损伤过程。

图6 流感病毒感染后不同时间BALF中IL-1β 和IL-23浓度的动态变化Fig.6 Dynamic changes of concentrations of IL-1β and IL-23 in BALF at different DPINote：A.IL-1β;B.IL-23;*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001.

3 讨论

NK细胞在H1N1重症感染小鼠肺组织炎症性病理损伤过程中发挥重要作用[20,21]。本研究发现H1N1重症感染组小鼠肺组织中γδT17细胞占总γδT细胞的比例和数目较对照组显著升高，且明显高于Th17细胞和Tc17细胞。结果表明：在H1N1重症感染组小鼠早期γδT17细胞是浸润肺脏的主要细胞，而非Th17细胞和Tc17细胞。感染后第3天BALF和血清中IL-17A浓度较对照组均显著升高。但BALF中IL-17A的浓度(图5A)明显低于血清中IL-17A的浓度(图5B)，可能是因灌洗液将肺泡分泌液中IL-17A浓度稀释所致。上述结果表明，流感病毒感染后被趋化募集至肺脏中的γδT17细胞可通过释放IL-17A参与早期肺组织炎症性病理损伤过程。此外，我们还发现，在感染后肺组织局部微环境中IL-1β、IL-23协同作用下，γδT17细胞也可能通过与肿瘤微环境和实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型微环境中γδT17细胞相同或相似的活化方式[20，23]，即γδTCR非依赖的作用方式活化，并通过释放IL-17A参与肺组织炎症性病理损伤过程。但上述γδTCR非依赖性活化途径尚需通过体内外实验进一步加以验证。实验结果2.3中，感染组小鼠Th17/Tc17细胞所占CD4+Th/CD8+Tc细胞的比例和数目较对照组显著升高(图4)，但与肺组织中IL-17A浓度升高无关的原因如下：Th17/Tc17细胞作为参与适应性免疫应答的多克隆T细胞，其中只有H1N1流感病毒特异性Th17/Tc17细胞能被相应流感病毒激活，并经克隆扩增后增殖分化为产生IL-17A的克隆细胞，但作为初次免疫应答这一过程通常需一周以上；而其他Th17/Tc17细胞不可能被H1N1流感病毒激活，也未见上述适应性免疫细胞(Th17/Tc17细胞)可被细胞因子非特异性激活产生IL-17A的研究报道。

在上述研究工作基础上，课题组(1)根据γδT细胞表达趋化因子受体8(C-C motif chemokine receptor 8,CCR8)[24]和微环境中TGF-β可诱导γδT细胞分化为γδT17细胞的研究报道[20]，拟对感染后肺组织中相关的趋化因子(CCL、CCL6)和TGF-β含量的动态变化及其来源进行深入探讨；(2)鉴于小鼠γδT细胞是一个异质性群体(包括Vγ1-Vγ7 7个亚群)，拟对肺脏中γδT17细胞的亚群归属、细胞毒性介质和其他炎性细胞因子的分泌，以及NKG2D和FasL的表达情况进行深入研究；(3)在确定γδT17细胞的亚群归属后，采用相应抗体进行干预将其清除，观测H1N1重症感染小鼠死亡率和肺组织炎症损伤能否改善。

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[收稿2016-08-22]

(编辑 许四平)

Distribution of γδT17/Th17/Tc17 cells in lung of H1N1 infected mice and their relationship with immunologic injury of lung

XUEChun-Xue,WENMing-Jie,LIUMeng,ZHANGXu-Long,CAOBin.

BeijingChaoyangHospital,AffiliatedMedicalUniversity,Beijing100020,China

Objective:To investigate the distribution of γδT17,Th17 and Tc17 cells in the lung of mice severely infected by influenza A(H1N1)pdm09 virus and the relationship between these cells with lung immunopathalogical injury.Methods：Intranasal infection was used to establish mouse model of severe H1N1 infection.Flow cytometry assay was used to detect the proportion and number of γδT17 cells,Th17 cells and Tc17 cells in the lung.The concentrations of interleukin-17A(IL-17A),interleukin-1β(IL-1β)and interleukin-23(IL-23) in the bronchoalveolar lavage fluid and serum were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay and Lu-minex assay.Results：①The model of mice severely infected by influenza A(H1N1)pdm09 virus was established successfully.②The ratio of γδT cells,but not CD4+T and CD8+T cells in total lymphocytes of the lung of infected mice significantly increased compared with uninfected control mice at the third day post infection(DPI)(P<0.01).③The proportion and number of γδT17 cells,Th17 cells and Tc17 cells in total γδT cells,Th cells and Tc cells in the lung of infected mice were significant higher than that in uninfected control mice at the first DPI,respectively.However,the absolute number of γδT17 cells was far more than Th17 and Tc17 cells(P<0.05)；④The concentration of IL-17A in BALF increased significantly after infection(P<0.05),and the concentration of IL-17A in serum increased significantly at the third DPI(P<0.05).The concentrations of both IL-1β and IL-23 in BALF probably participating in the activation of γδT17 cells increased significantly after infection compared with uninfected control mice.Conclusion：The γδT17 cells could be activated and secreted IL-17A via γδTCR non-depended pathway and involved in inflammatory pathological injury of lung at the early stage of severe H1N1 infection.

γδT cell;H1N1;Severe influenza;IL-17A

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.018

①本文为国家杰出青年科学基金(81425001/H0104)、国家自然科学基金(81271840、81373114)和北京市自然科学基金(7132072)资助项目。

薛春雪(1990年-)，女，在读硕士，主要从事呼吸系统H1N1感染免疫学研究，E-mail：1099185774@qq.com。

及指导教师：张须龙(1979年-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事肺脏的免疫学研究，E-mail：zhxlwl@ccmu.edu.cn。 曹 彬(1972年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事呼吸系统感染，呼吸道传染病等研究，E-mail：caobin_ben@163.com。

R392.1

A

1000-484X(2017)04-0563-06

②首都医科大学基础医学院免疫学系，微生态研究中心，北京 100069。

③首都医科大学附属北京中医医院，北京100010。

④中日友好医院呼吸中心，呼吸与危重症医学科，北京100029。