杨树花粉过敏BALB/c小鼠动物模型的建立①

杨琼梁 袁佳敏 黄星雨 颜 冲 杨仁义 苏啟后 李博杨 颜 红

(湖南中医药大学药学院，长沙410208)

·免疫学技术与方法·

杨树花粉过敏BALB/c小鼠动物模型的建立①

杨琼梁 袁佳敏 黄星雨 颜 冲②杨仁义③苏啟后④李博杨 颜 红

(湖南中医药大学药学院，长沙410208)

目的：建立杨树花粉粗提物致敏激发的小鼠过敏模型。方法：将60只BALB/c小鼠随机均分为正常组、卵清蛋白(OVA)阳性对照组和模型组，每隔5 d经腹腔注射致敏1次，共4次，末次致敏后第5天滴鼻激发。观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞变化情况；PAS染色观察气道黏液分泌情况；HE染色观察鼻黏膜、肺炎症情况；免疫组化法检测肺组织中IL-4及IFN-γ阳性细胞平均光密度值；酶联免疫吸附试验检测血清中的总IgE水平。结果：与正常组比较，模型组诱导鼻黏膜、肺组织出现明显的变应性炎症且气道黏液分泌明显增加；BALF涂片显示明显的炎症细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)增多；肺组织中IL-4阳性细胞平均光密度值均高于正常组，IFN-γ阳性细胞平均光密度值均低于正常组；血清中总IgE高于正常组。结论：杨树花粉粗提物能够成功建立小鼠过敏模型。该模型的建立有利于过敏性疾病机制的研究。

杨树花粉粗提物；过敏反应；动物模型

花粉是引起Ⅰ型变态反应疾病重要的致敏原之一，致敏花粉的种类因地区、海拔、季节的不同而有所不同。杨树是我国分布最广的树种，其每年产生的花粉及飞絮已成为春季主要的致敏花粉之一，常引起人类过敏性鼻炎、哮喘等过敏性疾病发作，临床上需给予抗炎、平喘、解痉等治疗[1]。鉴于人体试验的局限性和安全性，建立合适的动物模型来研究杨树花粉过敏显得尤为重要。许多不同品种的动物如豚鼠、大鼠、小鼠等已成功用于多种变应原炎症动物模型的构建，如尘螨、花生、卵蛋白等[2-4]。小鼠因其免疫遗传背景较清楚、来源广、品系较纯、价格低廉等优点，同时随着免疫学的发展及大量分子生物学试剂的出现，其应用于过敏模型的建立逐年增加。目前国内尚无资料直接显示Ⅰ型变态反应疾病患者中对杨树花粉过敏的比例，为此，本研究采用杨树花粉粗提物致敏和激发小鼠，初步探讨小鼠杨树花粉过敏的发病机理，为后续研究及开发治疗杨树花粉过敏药物提供良好的动物模型，同时也可为其他花粉过敏模型提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/c雌性小鼠60只，体重(18±2)g，购于湖南太平生物科技有限公司[许可证号：SCXK(湘)2015-0004]，饲养于湖南中医药大学动物实验中心[许可证号：SCXK(湘)2011-0003]。

1.1.2 药物与试剂 杨树花粉由中国林业科学研究院亚热带林业研究所提供，参照文献[5]制备得到杨树花粉粗提物；Albumin Egg购自Solarbio公司；氢氧化铝凝胶由本实验室自制；总IgE酶联免疫吸附反应检测(ELISA)试剂盒均购于欣博盛生物科技有限公司；IL-4免疫组织化学试剂购于武汉博士德生物工程有限公司；IFN-γ免疫组织化学试剂购自北京博奥森生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；ELX800酶标仪(基因有限公司)；Spectrumlab 722sp可见分光光度计(Lengguang Tech)；CP114型电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；KD2258型石蜡切片机(中国浙江金华)，Motic B5显微摄像图像分析系统(麦克奥迪实业集团公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将60只小鼠按体重随机分成3组，即正常组，卵清蛋白(OVA)阳性对照组，模型组。

1.2.2 动物免疫 参照文献[6]方法加以改进，OVA阳性对照组每只小鼠腹腔注射100 μg/ml的OVA 生理盐水(含5%氢氧化铝免疫佐剂)溶液0.1 ml。模型组将杨树花粉粗提物混悬于含5%氢氧化铝免疫佐剂生理盐水中，配成浓度为2 mg/ml的溶液，腹腔注射给予该组每只小鼠0.4 ml。正常对照组采用生理盐水溶液，注射方法、剂量均同阳性对照组。每间隔5 d重复致敏1次，共4次。

1.2.3 抗原激发 第4次致敏后的第5天进行滴鼻激发。阳性对照组所有小鼠给予40 μl(10 mg/ml)OVA溶液滴鼻激发；模型组所有小鼠给予40 μl(10 mg/ml) 杨树花粉粗提物滴鼻激发；正常对照组采取生理盐水进行滴鼻；每天1次，连续5 d。

1.2.4 血液的采集及处理 最后一次激发后24 h，眼窝取血，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，血清移至干净的Eppendorf管，-20℃保存。

1.2.5 鼻黏膜病理学检查 取双侧鼻组织，固定于10%甲醛中，石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察鼻黏膜局部炎症变化。

1.2.6 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集及处理 每组取10只小鼠切开颈部皮肤，行气管插管术，用含5%的胎牛血清生理盐水1 ml，分2次从气管插管缓慢注入肺内，缓慢收集，回收率为70%～80%(0.7～0.8 ml)。灌洗液2 000 r/min离心5 min后取沉淀涂片，干后进行HE染色，光学显微镜高倍镜下观察炎症细胞变化。

1.2.7 肺组织病理学检查及评分 往每组剩余小鼠肺中注入甲醛0.5 ml固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色和PAS染色，显微镜高倍镜下观察肺组织中炎症浸润程度及气道黏液分泌情况。采用Underwood的标准，依据血管周围和支气管周围嗜酸粒细胞浸润情况(分为0～5分)、组织水肿情况(分为0～5分)和肺组织中上皮损伤情况(分为0～5分)分别给每组小鼠评分，并计算出其平均总评分[7]。参照Henderson提供的方法，依据气道上皮着色情况(分为0～5分)确定支气管周围黏液分泌情况[8]。

1.2.8 肺组织中IL-4及IFN-γ表达 取固定好的小鼠肺组织，应用免疫组化法对肺组织中IL-4及IFN-γ的表达进行测定，采用图像分析系统检测。

1.2.9 血清中总IgE含量的测定 参照总IgE检测试剂盒说明书，酶联免疫吸附法测定血清中的总IgE含量。

2 结果

2.1 模型组出现过敏症状 模型组和OVA对照组小鼠于激发后均出现不同程度的烦躁不安或安静少动、立毛挠鼻、打喷嚏、呼吸加快加深、前肢缩抬、二便失禁等过敏反应表现；而正常组小鼠除有轻微挠鼻外无上述表现。

2.2 模型组鼻黏膜炎症细胞浸润明显 模型组及OVA对照组鼻黏膜上皮脱落，有大量炎症细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞及少量的中性粒细胞)浸润，而对照组鼻黏膜呈淡红色、光滑、黏膜结构正常，无炎症细胞浸润(图1)。

2.3 模型组BALF中炎症细胞浸润程度增加 模型组及OVA对照组BALF涂片中炎症细胞(嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞)显著高于正常组(P<0.05，图2)。

2.4 模型组肺组织炎症浸润程度及气道黏液分泌增加 HE染色及PAS染色结果表明：正常组小鼠肺组织切片未见明显病理学变化(图3A、D)；模型组气管、支气管及血管周围大量炎性细胞(肥大细胞、巨噬细胞、啫酸性粒细胞、淋巴细胞与中性粒细胞)浸润，上皮细胞脱落，间质大量中性粒细胞浸润(图3B)；OVA对照组气管、支气管及血管周围大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，支气管黏膜肿胀、破裂(图3C)，较之正常组(2.16±1.44)，模型组(14.39±1.79)及OVA对照组(15.96±2.03)肺组织炎症浸润程度显著增加(P<0.05)。模型组(4.5±0.97)及OVA对照组(4.7±0.68)较之正常组(0.5±0.85)PAS着色细胞明显增加，气道上皮杯状细胞增生，管腔中有黏液渗出，有的可见黏液栓(图3E、F)。

2.5 模型组肺组织中IL-4免疫反应性增强，IFN-γ免疫反应性降低 OVA对照组、模型组肺组织IL-4表达明显高于正常组，IFN-γ表达明显低于对照组(表1、图4)。

图1 鼻黏膜炎症细胞浸润程度(HE×200)Fig.1 Inflammatory cell infiltration in nasal mucosa(HE ×200)Note：A.Control group;B.Model group;C.OVA group.

图2 BALF中炎症细胞浸润程度(HE×200)Fig.2 Inflammatory cell infiltration in BALF(HE×200)Note：A.Control group；B.Model group；C.OVA group.

2.6 模型组血清中总IgE含量增加 OVA对照组、模型组血清中总IgE的含量显著高于正常组，OVA对照组与模型组之间无显著性差异(表2)。

图3 肺组织病理学变化(HE,PAS×400)Fig.3 Inflammatory cell infiltration in lung tissues(HE,PAS×400)Note：A.Control group of HE staining;B.Model group of HE staining;C.OVA group of HE staining;D.Control group of PAS staining;E.Model group of PAS staining;F.OVA group of PAS staining.

GroupsIL⁃4IFN⁃γControl0 19±0 030 52±0 08Model0 35±0 051)0 33±0 101)OVA0 38±0 081)0 30±0 121)

Note：Compared with control group，1)P<0.05.

图4 肺组织中IL-4、IFN-γ免疫反应性(×400)Fig.4 IL-4 immune reactivity and IFN-γ immune react-ivity in lung tissue(×400)Note：A.IL-4 expression of control group;B.IL-4 expression of OVA group;C.IL-4 expression of model group;D.IFN-γ expression of control group;E.IFN-γ expression of OVA group;F.IFN-γ expression of model group.

GroupsIgE/(ng/ml)Control9 71±1 26Model16 3±1 421)OVA15 14±0 941)

Note：Compared with control group，1)P<0.01.

3 讨论

目前研究认为，花粉过敏主要是由IgE介导的Ⅰ型超敏反应，机体吸入花粉变应原后产生IgE抗体，IgE与花粉变应原结合后黏附于嗜酸性细胞、肥大细胞表面，引起嗜酸性细胞浸润及炎症介质的释放，导致过敏性鼻炎、哮喘等疾病的发生。由于IgE存在血液循环中，过敏反应并不局限于局部，故本实验不仅对鼻黏膜、肺组织及BALF进行病理学检查，也对IgE抗体及相关细胞因子水平进行检测，以评价建立的过敏模型。

大量研究者采用OVA成功制备小鼠过敏模型，且OVA是过敏实验常用的阳性对照品，在本研究中选用其作为阳性对照，结果发现杨树花粉粗提物变应原及OVA能成功诱导小鼠过敏反应，均表现为挠鼻、打喷嚏次数增多，二便失禁，鼻黏膜炎症细胞浸润，肺部气管、小支气管及血管周围有明显的炎性细胞浸润，部分切片可见细支气管内含有黏稠痰液及黏液栓，并可见许多嗜酸性粒细胞浸润，PAS着色细胞明显增多；而正常对照组并无此症状。BALF中亦存在大量以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞，表明杨树花粉粗提物变应原效价与OVA过敏原相近。

目前公认的过敏反应发生的机制理论为过敏介质理论与Th1/Th2平衡理论，前者是研究最多的一种发生机制[9]，后者是较新的理论。研究报道认为，过敏性疾病是由Th2型细胞因子引起的免疫系统失调的疾病[10，11]。正常机体Th1、Th2细胞以及Th1型、Th2型细胞因子处于平衡状态，发生过敏反应时，细胞因子表达打破平衡，Th2型细胞因子过度表达，引起过敏反应。按此理论可将细胞因子的产生分为Th1型和Th2型，Th1型(IFN-γ、IL-2等)是介导炎症反应和迟发型的变态反应，其可以抑制Th2型细胞因子作用，起到保护气道作用[12]；Th2型(IL-4、IL-5、IL-6 等)主要介导的是速发型过敏反应及Ⅰ型超敏反应，其可使IgE合成增多，募集EOS向小气道浸润。在本试验中，我们发现与正常对照组相比，OVA对照组和模型组小鼠肺组织中IL-4阳性细胞平均光密度值显著增加，IFN-γ阳性细胞平均光密度值显著降低，表明杨树花粉粗提物与OVA致敏激发均诱导了小鼠Th2型免疫反应。由于实验条件的局限性，本实验仅观察了小鼠鼻黏膜、肺部炎症的病理学改变及与过敏反应相关的特异性细胞因子的变化，尚未观察此模型的气道反应性变化，有待后续实验的进一步完善。

综上可知，研究结果证实了本实验成功构建了杨树花粉诱导小鼠过敏反应模型，提供了一种杨树花粉粗提物诱导小鼠过敏模型的方法，并对杨树花粉过敏的发病机理及病理特征进行了研究，为杨树花粉引发的过敏性疾病的预防和治疗奠定了理论基础。

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[收稿2016-11-15 修回2016-12-08]

(编辑 许四平)

BALB/c mice model of allergic diseases induced by populus pollen

YANGQiong-Liang,YUANJia-Min,HUANGXing-Yu,YANChong,YANGRen-Yi,SUQi-Hou,LIBo-Yang,YANHong.

SchoolofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China

Objective:To study performed of develop a mice model of allergic diseases induced by crude extractings from populus pollen.Methods: A total of 60 BALB/c mice were divided randomly into there groups:normal control group,Albumin Egg(OVA) group and populus pollen model group with 20 in each.Mices were repeatedly sensitized by intraperitoneal injections of OVA or crude populus pollen extract every 5 d for four doses.Five days after the last sensitization,mices were repeatedly challenged by once daily antigen from 21-25 d.The changes of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were stained with hematoxylin and eosin(HE) to evaluate the degree of allergic inflammation.PAS staining was used to observe the secretion of airway mucus;The changes of the nasal mucosas and lungs of mice were stained with HE to evaluate the degree of allergic inflammation.And the average optical density of IL-4 and IFN-γ positive cells in lung tissue was measured by immunohistochemistry.The total IgE in the serum was also measured by enzyme-linked immunoassay(ELISA).Results: Compared with the mice in normal control group,those in OVA group and model group developed obvious allergic inflammation in the nasal mucosas and lungs,and increased airway mucus secretion.The number of inflammatory cells including eosinophil and neutrophils markedly increased in BALF smear.The average optical density of IL-4 positive cells in lung tissue was all increased in OVA group and model group compared with those in normal control group,and the average optical density of IFN-γ in lung tissue was on the contrary.The total IgE in the serum were all increased in OVA group and model group compared with those in normal control group,and the IFN-γ in the serum was significantly reduced in OVA group and model group compared with those in normal control group.Conclusion: Taken together,crude populus pollen extract can successfully induce a mice model of allergic diseases.This model is a useful tool in studying the mechanisms of allergic disease.

Crude populus pollen extract;Allergy;Animal models

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.016

①本文为国家林业公益性行业科研专项(201304103)和湖南省“中药学”重点学科项目(湘教通[2011]76号)。

杨琼梁(1992年-)，女，在读硕士，主要从事天然活性产物及中药新制剂的研究，E-mail：598789133@qq.com。

及指导教师：颜 红(1978年-)，女，博士，副教授，主要从事天然产物研究及中药新剂型及新技术的研究，E-mail：yh8632@126.com。

R363

A

1000-484X(2017)04-0554-04

②湖南中医药大学医学院，长沙 410208。

③湖南中医药大学中西医结合学院，长沙410208。

④湖南中医药大学中医学院，长沙410208。