雷公藤多苷抑制二肽肽酶I活性及其调节机制的研究①

王晶晶 蒋 媛 储 奕 柳 丽 周晓鹰

(常州大学制药与生命科学学院，常州213164)

雷公藤多苷抑制二肽肽酶I活性及其调节机制的研究①

王晶晶 蒋 媛 储 奕 柳 丽 周晓鹰

(常州大学制药与生命科学学院，常州213164)

目的：二肽肽酶I(DPPI)是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，高表达于颗粒免疫细胞包括肥大细胞，有激活炎症介质丝氨酸蛋白酶的功能。本研究用胶原诱导类风湿关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，探讨雷公藤多苷对DPPI的作用以揭示其治疗类风湿的药理机制。方法：Wistar大鼠随机分为正常组、模型组和雷公藤多苷治疗组(低剂量组2.5 mg/100 g 体重，高剂量组5 mg/100 g体重);用牛Ⅱ型胶原加完全弗氏佐剂诱导大鼠类风湿关节炎，两次免疫后第12天开始灌胃给药，连续2周后处死，收集血液和滑膜。关节切片HE染色和细胞计数，荧光底物法检测DPPI在大鼠血清和滑膜中的表达和活性，明胶酶谱法检测滑膜液中MMP-2/9表达水平，BCA法测定样品总蛋白含量。结果：和模型组相比，雷公藤多苷能降低CIA大鼠关节滑膜组织中肥大细胞的数量，并抑制滑膜液和血清DPPI的活性；滑膜总蛋白和MMP-2/9活性也有所降低。结论：雷公藤多苷对DPPI活性的抑制作用可能是其治疗类风湿药理学机制之一。

雷公藤多苷；CIA大鼠；二肽肽酶I；类风湿关节；基质金属蛋白酶

二肽肽酶I是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶(Dipeptidyl peptidase I，DPPI)，又称组织蛋白酶C，具有肽链外切酶的活性[1]。DPPI高表达于免疫颗粒细胞，如：肥大细胞、中性粒细胞和自然杀死细胞等。DPPI是丝氨酸蛋白酶(Serine proteases)，比如肥大细胞类糜蛋白酶(Chymase)、中性粒细胞弹性酶(Elastase)、自然杀死细胞颗粒酶A和B等炎症介质的重要激活酶[2,3]。丝氨酸蛋白酶是一个蛋白裂解酶家族，在炎症、过敏、凝血、损伤等过程中有重要作用。丝氨酸蛋白酶在细胞颗粒装配之前以酶原存在，需要DPPI在酶原的N端去除二肽之后，丝氨酸蛋白酶才会具有病理作用的酶活性功能[4]。其中肥大细胞释放专属性的丝氨酸蛋白酶类糜蛋白酶(Chymase)是前体基质金属蛋白酶-9(pro-matrix metalloproteinases-9，pro-MMP-9)的关键活化酶，在组织炎症的发展和重塑中发挥重要的作用[5]。

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性，全身性炎性关节疾病，表现滑膜关节损伤，导致关节软骨和关节的融合和破坏[6]。研究表明RA的关节腔和滑膜组织中，发现肥大细胞，中性粒细胞等颗粒免疫细胞的聚集[7,8]。DPPI基因敲除的老鼠对牛Ⅱ型胶原(Collagen-induced arthritis，CIA)诱导的类风湿关节炎具有抗性作用，并且在胶原诱导的关节炎模型中起到高强度的保护作用[9,10]。DPPI在类风湿疾病发病过程中的作用研究引起了我们的注意。

雷公藤多苷(Triperygium Wilfordii Polyglu-coside,TWP)是从卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilffordii Hook F,TwHF)有效部位去皮根中提取的混合物，是一种具有抗炎和免疫调节作用的活性成分[11]。大量的临床实验表明雷公藤多苷在类风湿关节炎临床治疗中具有独特的疗效，可以减轻RA患者症状、降低各种炎症介质表达水平、保护软骨和骨不被破坏等[12-15]。但是，雷公藤多苷治疗类风湿关节炎的药理机制尚不完全清楚。

本研究通过建立CIA大鼠模型来调查雷公藤多苷对DPPI的作用，从而进一步揭示雷公藤多苷的新的药理机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雷公藤多苷片(TG)(湖南协力药业有限公司)，牛Ⅱ型胶原蛋白(美国Chondrex),完全弗氏佐剂(CFA)(美国Sigma),Gly-Phe-4MβNA(瑞士Bachen),BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(上海碧云天生物技术有限公司),清洁级健康雌性Wistar大白鼠(常州卡文斯动物实验有限公司)，250 g，6～8周龄。荧光仪(LS55)(美国PerkinElmer)，微量高速冷冻离心机(美国，Thermofisher)。

1.2 方法

1.2.1 CIA 大鼠模型 动物实验过程中对动物的饲养和处置符合实验动物国家标准并得到常州大学生物医学伦理学学会的准许。参照文献[16]的方法，Wistar大鼠随机分为4组：正常组、模型组、雷公藤多苷低剂量治疗组和高剂量治疗组，每组4只。牛Ⅱ型胶原蛋白(2 mg/ml)与完全弗氏佐剂等体积混合(无菌操作)。对模型组和雷公藤多苷组的大鼠进行免疫，大鼠尾根部2 cm皮下注射胶原蛋白乳剂0.2 ml。初次致敏后第7天按照同样的方法加强免疫1次。

1.2.2 雷公藤多苷干预 Wistar大鼠2次免疫后第12天，治疗组使用雷公藤多苷(低剂量组2.5 mg/100 g 体重；高剂量组5.0 mg/100 g体重)分别与0.5%的羧甲基纤维素钠混匀灌胃，正常组和模型对照组大鼠每天灌注等量的羧甲基纤维素钠，持续2周。

1.2.3 大鼠关节切片HE染色和肥大细胞计数 给药两周后，取血处死动物，取大鼠后双肢关节，用40%的福尔马林溶液固定，脱钙，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察肥大细胞在关节滑膜中的浸润情况和细胞计数(单位细胞数平均值，n=5)。

1.2.4 大鼠血清和滑膜液匀浆的制备 分别从正常组、模型组及雷公藤多苷治疗组的大鼠(乙醚麻醉后)眼眶抽提静脉血，室温静置2 h后置冷冻离心机4℃，4 000 r/min，15 min离心，取上清液，置于-80℃冰箱中保存备用。参照文献[17]的方法处死大鼠后，纵行切开后肢膝关节正中皮肤，暴露出膝关节的区域，可见由髌骨下极向下延续的一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织，剥离滑膜组织，无菌冰生理盐水清洗。将滑膜组织称重，放入10 ml的小烧杯内。用移液管量取1/4滑膜体积的PBS含蛋白酶抑制剂(1 mmol/L)，剪刀处理为碎块后匀浆，5 min 后置4℃离心，3 000 r/min，20 min。取上清液，-80℃冰箱保存备用。

1.2.5 血清和滑膜液DPPI活性检测 96孔板，90 μl 含有0.5 mmol/L底物Gly-Phe-4MβNA的DPPI活性测定缓冲液(25 mmol/L柠檬酸，10 mmol/L NaCl)和10 μl的血清或滑膜液混匀，在激发波长335 nm和发射波长415 nm下检测荧光强度。

1.2.6 明胶酶谱法检测滑膜液中MMP-2/9的表达和活性 按照文献[17]报道的方法进行试验，将滑膜液与SDS电泳上样缓冲溶液(0.5 mmol/L Tris-HCl，甘油，10%SDS，0.1%溴酚蓝)以体积比1∶1的混匀上样，用含有1 mg/ml的明胶的8%分离胶进行电泳。电泳终止后凝胶置2.5% Triton X-100液中漂洗20 min，2次。于蛋白水解缓冲液(50 mmol/L Tris，0.2 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2，0.02% Triton X-100)中，并置37℃孵育过夜。第2天，0.5%考马斯蓝R-250染色30 min，然后用水脱色，直至可以看见清晰的白色条带。使用Bio-Rad凝胶成像仪拍照，ImageLab软件对胶块进行光密度分析。

1.2.7 BCA法测定滑膜液和血清总蛋白 用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取液中的蛋白浓度，按试剂盒的操作方法进行。以BSA作为标准蛋白并制定标准曲线，进而根据样品的OD值计算滑液或血清中总蛋白的浓度。

2 结果

2.1 雷公藤多苷降低CIA大鼠关节中肥大细胞的数量 组织学观察关节的炎症和骨组织的损伤,组织切片HE染色用于观察肥大细胞的浸润情况。图1A为模型组大鼠的HE染色情况，单位面积内的细胞数79.6±4.18。图1B为给药组单位面积内的细胞数59.2±3.02。相比之下，图1C显示给药组肥大细胞的数量比模型组减少25.6%(P=0.004)，表明雷公藤多苷减少了关节肥大细胞的局部浸润。

2.2 雷公藤多苷抑制CIA大鼠滑膜液和血清中DPPI活性 荧光检测结果如图2A所示，DPPI在滑膜液中的活性，模型组比正常组高93.9%(P=0.03),雷公藤多苷治疗2周后DPPI的活性较模型组降低57.1%(P=0.18)，和正常组比较差异无统计学意义(P=0.23)。图2B所示，在血清中，与正常组相比较，模型组的DPPI活性升高40.1%(P=0.12)；与模型组比较，雷公藤多苷高剂量组显著性地抑制DPPI的活性达58.9%(P=0.01)；而低剂量组的DPPI活性稍低于模型组，但差异无统计学意义(P=0.19)。与正常组比较,高、低剂量的雷公藤多苷治疗组大鼠DPPI活性差异均无统计学意义(P=0.52，P=0.41)。本实验中雷公藤多苷显示了对CIA大鼠滑膜液和血清中的DPPI有较好的抑制作用。

2.3 CIA大鼠滑膜液中MMP-2/9的表达和活性变化 明胶酶谱法结果如图3所示，滑膜液MMP-9的表达活性模型组的高于正常组59.7%(P=0.001)；和模型组比较，雷公藤多苷治疗后，MMP-9的活性降低56.5%(P=0.02)，与正常组相比差异无统计学意义(P=0.74)。MMP-2的表达活性，模型组显著高于正常组48.7%(P=0.001)。雷公藤多苷给药后，MMP-2的表达活性降低45.0%，与模型组比较差异有统计学意义(P=0.004)，与正常组比较差异无统计学意义(P=0.58)。MMP-2和MMP-9均恢复到正常水平。

图1 雷公藤多苷对CIA大鼠关节组织中肥大细胞的影响Fig.1 Effects of TWP on mast cells of CIA rats joint tissueNote: Joint tissue biopsy and mast cell distribution of CIA model group (A) and TWP treated group (B) stained with hematoxylin;C.The mean number of mast cells per reading area(n=5).**.P<0.01.

2.4 雷公藤多苷降低滑膜液中总蛋白的浓度 图4显示，在免疫后，CIA大鼠滑膜液中的总蛋白浓度要高于正常组68.1%(P=0.01)。经过雷公藤多苷治疗后滑膜液中总蛋白浓度比模型组降低43.5%(P=0.01)，与正常组相比差异无统计学意义(P=0.1)，说明雷公藤多苷可以减轻CIA大鼠滑膜炎症症状。

图2 雷公藤多苷对CIA大鼠滑膜液(A)和血清(B)中DPPI活性的影响Fig.2 Effect of TWP on DPPI activities in SFs (A) and serum (B) of CIA ratsNote: *.P<0.05.

图3 明胶色谱法检测各组滑膜液中MMP-2/9的表达Fig.3 Geletin-Zymography analysis of MMP-2/9 in SFs from different groupsNote：A.Expressions and activities of MMP-2/9 in SFs from different groups(geletin gel);MMP-2 (B) and MMP-9 (C) integrated optical density analysis (Imagelab software,semi-quantitation).*.P<0.05；**.P<0.01.

图4 各组的大鼠滑膜液中总蛋白浓度Fig.4 Total protein concentration in SFs of rats from different groupsNote: *.P<0.05.

图5 雷公藤多苷通过抑制DPPI进一步调控下游蛋白酶以治疗类风湿的新的药理机制示意图Fig.5 Schematic view of a new pharmaceutical mechanism of TWP in RA treatmentNote：A.Pathological role of DPPI in synovial inflammation and RA development;B.The inhibitory effects of TWP on DPPI activity and its downstream regulation.

3 讨论

我们的研究结果表明，雷公藤多苷使CIA大鼠滑膜中的DPPI活性显著下降，血清中DPPI的含量及活性亦显著降低，雷公藤多苷和治疗效果呈一定的剂量依赖关系，说明在类风湿关节炎的治疗过程中雷公藤多苷的作用机制可能与降低DPPI的活性有关。雷公藤多苷使CIA大鼠关节滑膜中的肥大细胞数量降低，表明雷公藤多苷也可能通过降低肥大细胞在关节滑膜组织的招募或增殖来降低DPPI的总量从而显示较低的DPPI活性。

细胞外基质(Extracellular matrixc，ECM)是骨组织结构完整的重要组成成分。RA患者关节软骨和骨组织中的MMPs可降解RA的骨组织和关节软骨中的黏蛋白，胶原蛋白以及ECM中的其他组成成分，从而加速浆细胞、巨噬细胞及淋巴细胞对软骨的破坏，形成遍及全身的关节滑膜炎。其中MMP-2和MMP-9属于明胶酶，可以降解关节软骨组织中必不可少的多种胶原、蛋白多糖和层黏连蛋白[18]。明胶酶谱法的检测结果表明雷公藤多苷使MMP-9和MMP-2的表达和活性得以降低，说明雷公藤多苷也许通过调节DPPI的活性和调节肥大细胞的数量进一步影响肥大细胞蛋白酶的活性从而降低了对MMP-9和MMP-2的活性；雷公藤多苷也许通过抑制关节组织细胞的活性从而降低MMP-9和MMP-2细胞分泌。

RA主要的病理变化是关节滑膜的慢性炎症反应。炎症发生时，会导致免疫细胞的产生即导致球蛋白的增高；血管壁通透性增加，血液流速变慢，血浆渗出，使血液浓缩即白蛋白以及球蛋白浓度升高。我们的结果表明CIA模型组中总蛋白的浓度明显高于正常组，而雷公藤多苷可以降低滑膜液中总蛋白浓度，由此可以看出雷公藤多苷可以减缓炎症的发展。

综上所述，并如图5所示，雷公藤多苷对CIA大鼠类风湿疾病的发展具有一定的抑制作用，其药理作用可以通过抑制血清和滑膜中DPPI活性，从而抑制下游的糜蛋白酶酶原激活，并进一步抑制或降低MMP-2和MMP-9活性，以减轻类风湿关节炎的炎症表征。同时，雷公藤多苷通过降低局部肥大细胞数量或抑制肥大细胞活性，以降低类风湿关节炎的伤害。本研究结果显示了雷公藤多苷对血液和滑膜组织DPPI活性的抑制作用以及对肥大细胞数量的调控，揭示了雷公藤多苷对类风湿治疗作用的新的药理机制。

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[收稿2016-09-14 修回2016-12-21]

(编辑 张晓舟)

Study on inhibitory effects of Triperygium Wilfordii Polyglucoside on Dipeptidyl peptidase I and regulatory mechanism

WANGJing-Jing,JIANGYuan,CHUYi,LIULi，ZHOUXiao-Ying.

TheSchoolofPharmaceuticalEngineeringandLifeScience,ChangzhouUniversity,Changzhou213164,China

Objective:Dipeptidyl peptidase I(DPPI),a lysosomal cysteine protease for serine proteases activation,highly expressed in granule immune cells.This study used collagen induced arthritis(CIA) rat model to investigate the effects of Triperygium Wilfordii Polyglucoside(TWP) on DPPI activity and the pharmacological mechanism in RA treatment.Methods：Rats were divided into four groups randomly,the blank control group,the CIA model group,the high dose (5.0 mg/100 g body-weight) and low dose(2.5 mg/100 g body-weight)treatment group.Bovine collagen-Ⅱ plus complete Freund′s adjuvant injected twice in rats.Physical assessments were carried out.12 days post-injections,the rats of treatment group were intragastric administered with TWP every day.The rats were killed after two week administrations.Serum and synovial membrane homogenates were collected and DPPI activity was detected by fluorescence substrate.Joint HE staining and cell counting were carried out，Zymography was used to detect the MMP-2/9 activity in synovial fluids.Total protein in synovial membrane homogenates were measured by BCA method.Results：TWP could reduce the number of CIA synovial tissue mast cells，inhibited DPPI activity in the synovial fluids and in serum.The expression levels of MMP-2/9 activity and synovium total protein content were also reduced by TWP.Conclusion：Triperygium Wilfordii Polyglucoside has inhibitory effects on DPPI activity on CIA rats,which might be the one of the pharmacological mechanisms in RA treatment.

Triperygium Wilfordii Polyglucoside;CIA rat;Dipeptidyl peptidase I;Rheumatoid arthritis;Matrix metallo-proteinases

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.012

王晶晶(1990年-)，女，在读硕士，主要从事免疫药学研究。

及指导教师：周晓鹰(1957年-)，女，博士，常州大学特聘教授，英国Southampton University 客座教授，博士生导师，主要从事免疫药学、生物医学和生物诊断技术的研究，E-mail： xiaoyingzhou@ccu.edu.cn。

R730.5

A

1000-484X(2017)04-0537-05

①本文为常州大学高层次人才引进启动基金(ZMF14020066)和常州科技局国际交流研究基金(KYJ1520305)。