FGF8辅助牙源性上皮诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞*

刘 皓， 姜建萍， 张娟娟， 潘智芳， 李孟杰， 梁 铮 ， 赵翔宇， 孙 岩， 刘晓影△

(1潍坊医学院生物科学与技术学院, 山东 潍坊 261053； 2潍坊市中医院脑病康复科，山东 潍坊 261041； 3潍坊医学院口腔教研室，山东 潍坊 261053)

·短篇论著·

FGF8辅助牙源性上皮诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞*

刘 皓1， 姜建萍2， 张娟娟3， 潘智芳1， 李孟杰1， 梁 铮1， 赵翔宇1， 孙 岩3， 刘晓影1△

(1潍坊医学院生物科学与技术学院, 山东 潍坊 261053；2潍坊市中医院脑病康复科，山东 潍坊 261041；3潍坊医学院口腔教研室，山东 潍坊 261053)

目的： 研究成纤维细胞生长因子8(FGF8)对成人牙髓干细胞(hDPSCs)定向分化为成牙本质细胞及牙髓组织的影响。方法: 首先分离、克隆培养hDPSCs，通过流式细胞术检测细胞表面标志物鉴定hDPSCs；矿化液中添加50 μg/L的FGF8诱导hDPSCs分化，通过real-time PCR检测分化后的细胞中牙本质涎磷蛋白(DSPP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)和核心结合因子α1(Cbfa-1)在mRNA水平的表达；E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8与hDPSCs细胞团重组，再将组织块种植于裸鼠肾囊膜下培养，通过DNA原位杂交鉴定成牙本质细胞及牙髓细胞的来源。结果: 成功分离培养hDPSCs，其表面标志物CD29和CD90呈阳性表达；经FGF8诱导的hDPSCs形成较明显的矿化结节，并且牙本质特异性蛋白DSPP、BSP及Cbfa-1表达量上调；E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8可以诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞。结论: FGF8能够辅助牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓细胞，并形成牙本质及牙髓腔结构。

成纤维细胞生长因子8; 成人牙髓干细胞; 成牙本质细胞

成人牙髓干细胞(human postnatal dental pulp stem cells，hDPSCs)是从人恒牙牙髓中分离出来的具有克隆形成能力及快速分裂特征的成纤维样干细胞[1]。牙髓干细胞能够定向分化为成牙本质细胞、脂肪细胞及神经细胞[2-3]， Tamaoki 等[4]把hDPSCs 成功地诱导为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)参与胚胎生长发育、器官形成、肿瘤发生及转移、组织损伤修复等过程[5-6]，其家族成员FGF8在口腔上皮不表达时会导致磨牙缺失。目前关于FGF8对hDPSCs分化的影响尚无报道。因此，本研究在体外培养hDPSCs并进行定向诱导，在体内建立组织培养模型，初步研究FGF8对hDPSCs分化及形成牙齿结构的影响。

材 料 和 方 法

1 主要材料

裸鼠购自上海中科院实验动物中心；成人第3磨牙由潍坊医学院口腔医院提供；α-MEM、胎牛血清、FGF8、 I型胶原酶、中性蛋白酶和鼠尾胶原蛋白(Gibco)；维生素C、β-磷酸甘油钠、地塞米松和茜素红(Sigma)；Alu及Pf1探针由上海生物工程有限公司合成；琼脂糖微球(Bio-Rad)；SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa)；CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC和CD45-PE(BioLegend)。

2 主要方法

2.1 分离培养hDPSCs 从潍坊医学院口腔医院获得成人(20～30岁)智齿(第3磨牙)，在无菌条件下，敲碎牙冠暴露牙髓，用手术刀将牙髓切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，用含有双抗的PBS冲洗2～3遍；再用消化液(3 g/L I型胶原酶和4 g/L 中性蛋白酶)在37 ℃消化40 min；终止消化后吹打至单细胞悬液，接种于0.1 g/L鼠尾胶原蛋白预包被的培养皿中；37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后换液继续培养2～3 d，细胞成簇生长，呈现克隆状，选取干细胞形态的克隆，利用套环法挑取单克隆，置于鼠尾胶原包被的48孔板中继续培养。

2.2 通过流式细胞术检测hDPSCs细胞表面标志物 0.25%胰蛋白酶消化第3代(P3) hDPSCs，1×PBS洗涤细胞3次，并吹打成细胞悬液。抗CD29、CD90和CD34的抗体为FITC标记，抗CD45抗体使用PE标记，将抗体分别加入细胞悬液，最终抗体被稀释为1∶100，室温避光孵育30 min后，再用PBS洗涤3遍。依照Beckman Coulter流式细胞仪的操作手册，检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34及CD45的表达。

2.3 矿化液诱导hDPSCs分化并检测其矿化程度 将P3 的hDPSCs以1×107/L的密度接种于胶原蛋白预包被的3.5 cm2培养皿中，培养3 d后将培养液更换为可以诱导分化的矿化液(α-MEM，10% 胎牛血清，50 mg/L维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油钠，10 nmol/L地塞米松)，矿化诱导培养14 d后，终止培养，用冰冷的70%乙醇固定1 h，再用1 mL 40 mmol/L茜素红(pH 4.1)染色10 min，进行镜检矿化结节。

2.4 Real-time PCR检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein， BSP)和核心结合因子α1(core-binding factor alpha 1,Cbfa-1)的mRNA表达 设计成牙本质细胞中矿化相关标志物 DSPP、ALP、BSP及Cbfa-1和内参照GAPDH的引物，以未经矿化液诱导分化、矿化液诱导分化14 d及含50 μg/L FGF8的矿化液诱导分化14 d的hDPSCs cDNA为模板，根据SYBR PrimeScript RT-PCR 试剂盒说明书，利用real-time PCR来鉴定hDPSCs分化程度，引物序列见表1。用2-ΔΔCt方法分析各基因的相对表达水平。

表1 引物序列

2.5 FGF8诱导重组嵌合体的制备及其体内种植培养 在无菌条件下，将琼脂糖微球浸泡于100 μg/L的FGF8溶液中，37 ℃培养箱中孵育1 h，使其完全膨胀，以吸附牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的琼脂糖微球为对照。将浸泡过的琼脂糖微球(4～6粒)均匀置于P4的hDPSCs细胞团块边缘，将在体视显微镜下分离获得昆明小鼠胚胎11.5 d(E11.5)的牙上皮覆盖其上。将重组嵌合体在器官培养皿内，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。再将重组嵌合体种植于裸鼠肾囊膜下进行体内培养6周。

2.6 DNA原位杂交 Alu和Pf1分别是人及小鼠基因组中特有的高度重复序列，均具有种属特异性，因此地高辛标记的Alu和Pf1探针能够特异性地分别检测出人源及鼠源组织。Alu及Pf1探针由上海生物工程有限公司合成：用含有地高辛标记的dUTP，以PCR方法扩增特异性的Alu及Pf1探针(引物见表1)，石蜡切片经脱蜡复水后，蛋白酶K(1 mg/L)37 ℃消化10 min，浸入0.2%甘氨酸5 min，4%多聚甲醛室温下固定10 min，乙酸酐/三乙醇胺孵育10 min，每片加100 μL杂交液(含1 mg/L探针)，95 ℃水浴锅中变性10 min，Alu探针在37 ℃，Pf1探针在30 ℃下分别杂交过夜(16 h)。滴加封闭液，室温放置20～30 min。加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体稀释液，室温放置2 h。加NBT/BCIP显色液，4 ℃避光显色过夜。充分水洗，伊红复染1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

3 统计学处理

本研究采用 SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计学分析。数据描述采用均数±标准差(mean±SD)形式表达，数据分析采用两因素重复测量设计方差分析方法。各实验组与其对应的对照组比较采用Dunnett-t检验方法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 hDPSCs的分离培养及初步鉴定

套环法挑取单克隆培养2 d后在显微镜下可以观察到长梭型的细胞分散生长，继续培养6 d后可见生长为致密的长纤维状。取克隆培养后的P3细胞经流式细胞术检测表面标志物，结果显示，作为骨髓及牙髓干细胞表面标志物的CD29及CD90呈阳性表达，阳性率分别为96.3%和94.5%；而造血干细胞特异性表面标志物CD34及粒系细胞的共同表面标志物CD45阳性率较低，见图1。该检测结果说明已经成功分离培养hDPSCs。

2 FGF8促进矿化液诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞

Figure 1.Isolation, culture and identification of hDPSCs. A: clonal culture of hDPSCs for 2 d and 8 d; B: the surface markers of hDPSCs were detected.

图1 hDPSCs的分离培养及初步鉴定

用矿化液及含50 μg/L FGF8的矿化液培养hDPSCs，诱导分化14 d后细胞呈复层生长均有矿化结节出现，用茜素红染色均显示为阳性(图2A中黑色箭头所示)，而FGF8组单个矿化节结面积较大，在一定程度上也反映了细胞矿化能力的增强，说明FGF8可增强hDPSCs的分化能力。

以未经矿化液诱导分化、矿化液诱导分化14 d及含50 μg/L FGF8的矿化液诱导分化14 d的hDPSCs cDNA为模板，利用real-time PCR来鉴定hDPSCs分化程度。结果显示未经诱导的hDPSCs几乎不表达牙本质特异性蛋白DSPP及BSP，经矿化液诱导以后DSPP、BSP、ALP及Cbfa-1的表达均有不同程度的上调，尤其是FGF8组中Cbfa-1的表达量明显上调，见图2B。该结果说明FGF8能够促进hDPSCs向成牙本质细胞的分化。

3 FGF8辅助E11.5小鼠牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓结构

FGF8联合E11.5小鼠牙源性上皮与P4的hDPSCs进行重组，种植于裸鼠肾囊膜下培养6周后，取出组织块，切片后分别进行Alu和Pf1的DNA原位杂交，对照组以BSA代替FGF8。结果FGF8组10例中有4例形成牙本质及牙髓结构，而对照组10例中均未形成牙齿结构。FGF8组具有牙齿结构发育的组织块大而圆润，而对照组未能形成牙齿结构的组织块呈扁平骨基质状。将组织块切片后，经Alu和Pf1的DNA原位杂交结果显示，FGF8组能够形成的牙齿结构，成釉细胞核被Pf1探针识别染色为紫色，说明成釉细胞来源于鼠组织；成牙本质细胞及牙髓细胞核被Alu探针识别，说明这些细胞由人源组织(hDPSCs)发育而来。而对照组无牙齿结构出现，仅发现角化上皮及松骨质，见图3。此结果提示FGF8可以辅助E11.5小鼠牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓结构。

Figure 2.The effect of FGF8 on the differentiation of hDPSCs. The hDPSCs were cultured with the mineralization fluid (MF) and the MF containing 50 μg/L FGF8 for 14 d. A: alizarin red staining (×200)； B: the mRNA expression levels of cell mineralization-related genes, DSPP, ALP, BSP and Cbfa-1, were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=9.*P<0.05vshDPSCs+MF.

图2 FGF8对hDPSCs分化能力的影响

讨 论

hDPSCs是从人恒牙牙髓中分离出来的具有克隆形成能力及快速分裂特征的成纤维样干细胞，此种细胞拥有比骨髓干细胞更强的克隆形成能力和分裂潜能，其在牙髓中的含量明显高于骨髓中骨髓干细胞的含量[1]。大量研究已表明[2-3]，牙髓干细胞能够定向分化为成牙本质细胞，并且可以分泌DSPP、BSP等牙本质形成相关蛋白，但牙髓干细胞是否能参与形成牙齿结构目前尚无报道，所以这是一项值得研究的课题。

FGF8作为成纤维细胞生长因子家族成员，不仅参与胚胎发育、细胞生长、器官形成以及损伤修复等一系列重要的过程，还是牙齿发育过程中的一个重要因子[5-6]。在牙齿发生启动之前，未来牙上皮就已经开始有强烈的FGF8表达并持续到蕾状早期，FGF8可以诱导未来磨牙间充质中Barx1的表达[7-9]。然而，FGF8是否为指导性诱导成牙潜能的成份尚不明确，因为当口腔上皮不表达FGF8时，切牙可以形成，但会缺失包括磨牙在内的其它第一腮弓衍生物[10]。

Figure 3.The effects of FGF8 on dental epithelium-induced directional differentiation of hDPSCs into odontoblasts and pulp tissue. A, D: the tissue of tooth structure in FGF8 group (D) and no teeth structure block in control group (A) under the renal capsule of nude mice were observed; B～C: DNAinsituhybridization in control group for Pf1 (B) and Alu (C); E～F: DNAinsituhybridization in FGF8 group for Pf1 (E) and Alu (F). ep: epithelial cells; b: loose bone; eb: the enamel cells; od: the dentin cells; d: dentin; dp: pulp tissue.

图3 FGF8辅助小鼠牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓结构

本研究主要观察FGF8对hDPSCs分化的影响，是否有助于定向诱导hDPSCs分化为成牙本质细胞及牙髓结构。其研究结果对未来牙齿硬组织再生和牙齿损伤修复的研究都具有重要的意义。在本研究中，矿化液中添加50 μg/L的FGF8能够促进hDPSCs矿化结节的形成，并且经定向诱导后细胞中DSPP、BSP及Cbfa-1表达量均明显高于未添加FGF8组，DSPP作为牙本质特异性蛋白，也是分化成熟的牙本质细胞特异性的标记物；BSP为矿化组织细胞基质中的重要成分；Cbfa-1作为骨和牙齿发育过程中一个重要的转录因子，在牙齿发育的早期阶段高表达，参与牙冠的形成和成牙本质细胞的分化。DSPP、BSP及Cbfa-1表达量的升高也反映了hDPSCs的分化程度，提示FGF8能够促进hDPSCs向成牙本质细胞的分化。

为了进一步证实FGF8对hDPSCs分化的影响，本研究又实施了体内实验，E11.5小鼠牙源性上皮联合FGF8与hDPSCs细胞团重组，再将组织块种植于裸鼠肾囊膜下继续发育，模拟体内发育环境。结果发现FGF8组10例中有4例形成牙本质及牙髓结构，而对照组10例中均未形成牙齿结构。并通过DNA原位杂交技术确定牙本质细胞及牙髓细胞来源于hDPSCs。该结果说明FGF8作为影响hDPSCs分化的因素之一，可以辅助E11.5小鼠牙源性上皮定向诱导hDPSCs分化成牙本质细胞及牙髓结构。本研究结果与已有的文献报道相一致，碱性成纤维生长因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)不仅仅诱导间充质干细胞分化[11]，还可以诱导hDPSCs分化。Qian等[12]使用bFGF预处理hDPSCs 1周后再进行定向分化诱导，发现hDPSCs向成牙本质细胞分化能力上调；而Kikuchi等[13]用含有bFGF 的明胶凝胶控释系统，对有牙本质缺损暴露的牙髓组织恒速释放bFGF，发现牙本质样颗粒的形成；He等[14]也证实了bFGF可显著增加牙髓干细胞向成骨/成牙本质方向分化。本研究发现同样作为成纤维生长因子家族成员之一的FGF8，不但能够诱导hDPSCs向成牙本质细胞分化，还可以分化为牙髓样细胞，形成完整的牙齿结构——牙本质及牙髓。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Role of fibroblast growth factor 8 in process of dental epithelium-induced directional differentiation of human postnatal dental pulp stem cells into odontoblasts and pulp cells

LIU Hao1, JIANG Jian-ping2, ZHANG Juan-juan3, PAN Zhi-fang1, LI Meng-jie1, LIANG Zheng1, ZHAO Xiang-yu1, SUN Yan3, LIU Xiao-ying1

(1InstituteofBiologicalScienceandTechnology，WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;2DepartmentofEncephalopathyRehabilitation,WeifangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Weifang261041,China;3DepartmentofStomatology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail:xiaoying6690@163.com)

AIM: To study the effects of fibroblast growth factor 8 (FGF8) on directional differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs) into odontoblasts and pulp tissue. METHODS: hDPSCs were isolated and cultured, and identified with flow cytometry by detecting cell surface markers of hDPSCs. FGF8 at concentration of 50 μg/L was added into the mineralization fluid to induce the differentiation of the hDPSCs. The mRNA expression of dentin sialophosphoprotein (DSPP), alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP) and core-binding factor alpha 1 (Cbfa-1) in differentiated cells was detected by real-time PCR. FGF8 and mouse E11.5 dental epithelium formed restructuring cell group with hDPSCs, and then the restructuring cell group was transplanted under renal capsule membrane in nude mice for tissue culture. DNAinsituhybridization was used to identify the sources of odontoblasts and pulp cells. RESULTS: The surface markers of CD29 and CD90 showed positive in isolated hDPSCs. FGF8 induced hDPSCs to form a distinct mineralization nodule, and the expression of dentin-specific proteins, DSPP, BSP and Cbfa-1, was increased. hDPSCs were induced to differentiate into odontoblasts and pulp cells by E11.5 dental epithelium and FGF8. CONCLUSION: FGF8 can assist dental epithelium to induce directional differetiation of hDPSCs into odontoblasts and pulp cells, and formation of dentin and dental pulp cavity structure.

Fibroblast growth factor 8; Human postnatal dental pulp stem cells; Odontoblasts

1000- 4718(2017)04- 0730- 05

2016- 11- 11

2016- 12- 22

国家自然科学基金资助项目(No. 81441107)；山东省自然科学基金资助项目(No. ZR2013HQ019)；山东省高等学校科技计划项目(No. J15LK09)；潍坊医学院大学生科技创新项目(No. KX2016002)

R363； R781

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.025

△通讯作者 Tel: 0536-8462053; E-mail： xiaoying6690@163.com