急性淋巴细胞白血病患者FGFR3表达对循环内皮细胞增殖的影响*

吴静怡， 周剑峰， 裴仁治△， 张丕胜， 刘旭辉， 杜小红

(1宁波大学医学院附属鄞州医院血液科， 浙江 宁波 315000； 2华中科技大学同济医学院同济医院血液科， 湖北 武汉 430030)

急性淋巴细胞白血病患者FGFR3表达对循环内皮细胞增殖的影响*

吴静怡1， 周剑峰2， 裴仁治1△， 张丕胜1， 刘旭辉1， 杜小红1

(1宁波大学医学院附属鄞州医院血液科， 浙江 宁波 315000；2华中科技大学同济医学院同济医院血液科， 湖北 武汉 430030)

目的： 了解急性淋巴细胞白血病(ALL)患者成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)表达对循环内皮细胞(CECs)增殖的影响。方法: 通过RT-PCR法检测44例ALL患者骨髓中FGFR3 mRNA表达，分成FGFR3+组及FGFR3-组进行Kaplan-Meier生存分析。利用免疫磁珠结合流式细胞术分离计数CECs，对比两组CECs数量、表面抗原表达、生长曲线及集落生成数的差异。免疫荧光组化染色测定CECs表面FGFR3表达水平。结果: 44例核型正常ALL患者中FGFR3 mRNA表达阳性率为43.2%，T-ALL组的FGFR3表达高于B-ALL组(P<0.05)。19 d骨髓原始细胞比例≥5%的患者FGFR3表达升高(P<0.05)。FGFR3阳性组的总生存率明显低于阴性组(P<0.05)。分离出的CECs高表达CD31、CD144、VEGFR-2和CD146，基本不表达CD45。与FGFR3阴性组相比，阳性组CECs数量、CD133的阳性率及集落生成数均增多(P<0.05)。体外培养中，FGFR3阳性组与阴性组相比，生长曲线3个时点上的细胞数差异有统计学显著性(P<0.05)。19例ALL-FGFR3+患者CECs表面均能检测到FGFR3表达，阳性率为29.00%±15.71%。结论: 致癌基因FGFR3对ALL患者CECs的增殖有促进作用，可能具备了抗肿瘤及抗血管生成的双重靶点身份，可以为今后的分子治疗提供更多的选择。

急性淋巴细胞白血病； 成纤维细胞生长因子受体3； 循环内皮细胞

成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors，FGFR)属于酪氨酸激酶家族，参与细胞的生长、分化及迁移[1]。最新的研究显示其抑制剂不仅作用肿瘤细胞，对于肿瘤微环境也同样有效[2]。FGFR3是其成员之一，与肿瘤转移及淋巴结浸润关系密切[3]，在慢性粒细胞白血病、恶性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤中都有过表达[4]。Chesi 等[5]发现约25%多发性骨髓瘤患者发生t (4; 14) (p16.3; q32.3) 易位，导致FGFR3基因过度表达而致瘤。本研究旨在探讨急性淋巴细胞白血病(acute lymphocy-tic leukemia，ALL)中FGFR3对循环内皮细胞增殖的影响，揭示其在疾病预后判断中的意义及作为治疗靶点的潜在价值。

材 料 和 方 法

1 研究对象

2008年12月至2016年3月期间我院初诊的ALL患者44例，男性28例，女性16例，中位年龄32岁(14～78岁)。诊断均采用MICM分型确诊。所有ALL患者均经融合基因及染色体分析判断为核型正常，采取CALLG2008方案进行治疗，疗效标准根据《血液病诊断及疗效标准》评价[6]。对所有患者进行随访。

2 试剂和仪器

人淋巴细胞分离液(Ficoll)购自中国医学科学院生物工程医学研究所；TRIzol试剂和Oligo(dT)16购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自Promega；PCR试剂盒购自Fermentas；PCR引物均由上海博亚公司合成。内皮细胞完全培养基(EGM-2 MV Single Quots)和胰蛋白酶为Becton Dickinson产品； FGFR3鼠抗人单抗购自Santa Cruz；VEGFR-2鼠抗人单抗购自R&D； CD31鼠抗人单抗购自上海长岛；羊抗鼠FITC标记的 II 抗购自Sigma；PE标记的CD144鼠抗人单抗购自Beckman Coulter； FITC标记的CD133、FITC标记CD45和PE标记的CD146鼠抗人单抗均购自BD；CD146磁珠溶液购自Miltenyi Biotec。PCR仪为Biometra T3000型；FACSCantoTMII型流式细胞仪购自BD。

3 实验方法

3.1 FGFR3 mRNA表达的检测 取骨髓血5 mL用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，TRIzol一步法抽取总RNA，按Promega试剂盒说明书操作步骤合成cDNA链。利用Oligo 6.0软件自行设计引物。FGFR3的上游引物为5’-GTGACGCACAGCCCCACATCC-3’，下游引物为5’-GGCCCGAGACAGCTCC CATTT-3’，扩增片段长度为549 bp；内参照GAPDH的上游引物为5’-AGCGAGATCCCTCCAAA-3’，下游引物为5’-TTCCACGATACCAAAGTTGT-3’，扩增片段长度为281 bp。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 min，30个循环；72 ℃ 10 min。取10 μL扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳后溴化乙啶染色，凝胶成像扫描系统分析照相，根据特异条带的有无分别记为阳性和阴性。具体方法详见文献[7]。

3.2 CECs的分离及计数 静脉血(EDTA抗凝)5 mL用PBS 1∶1稀释，加入红细胞裂解液静置10 min，洗涤后弃去上清，与FCR阻断剂置于4 ℃30 min，与CD146磁珠溶液室温孵育25 min，洗涤后上柱分选CD146阳性的细胞，富集的细胞调整体积至300 μL，均分成样品管(T2)及空白对照管(T1)，两管中均加入FIFC标记的CD45单克隆抗体20 μL，T2管中加入PE标记的CD146单克隆抗体20 μL，T1管中加入20 μL同型对照，调整溶液体积至200 μL。4 ℃保存至上机检测。流式细胞术检测CD146+CD45-PI+的有核细胞。具体方法详见文献[8]。

3.3 细胞表面抗原的免疫荧光检测 得到的细胞悬液制成细胞滴片及爬片，PBS冲洗后，用4%多聚甲醛在室温下固定30 min，用小牛血清封闭30 min去除非特异性标记，加工作浓度的 I 抗及FITC标记的 II 抗，严格按照说明步骤进行，结果在荧光显微镜下观察，计数200个细胞。

3.4 细胞生长曲线的绘制 取生长良好CECs，增长至接近汇合时向培养瓶内加入0.25%的胰酶消化后，加入完全培养基制成细胞悬液计数。向24孔板的每孔中接种等量细胞， 于37 ℃恒温CO2培养箱中静置培养。将细胞分成4组，每组3孔，培养7 d。从培养第3天开始计数，每24 h分别取3个孔计数，取平均值，以时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制FGFR3-组、FGFR3-+ 酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)组(在培养基中加入浓度为50 μg/L的aFGF)及FGFR3+组CECs的生长曲线。

3.5 细胞集落形成率测定 取接近融合细胞，洗涤消化后制成细胞悬液，按2×104/L的密度接种到6孔板中培养，当培养板中出现克隆时，终止培养，弃去培养液，用PBS洗涤后加甲醛5 mL固定细胞15 min，加适量姬姆萨液染色30 min，计数孔中集落数，以含50个以上细胞团为1个集落。每次培养6个孔，取平均值。

4 统计学处理

所有数据采用统计学软件SPSS 16.0进行分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。FGFR3 mRNA表达与临床指标的关系均采用卡方检验及精确检验法。生存分析采用Kaplan-Meier法，总生存率(overall survival，OS)时间定义为从患者自确诊之日起至死亡或末次随访日期。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 FGFR3表达水平与临床特征及预后的相关性

44例核型正常ALL患者中FGFR3 mRNA表达阳性为19例(43.2%)，2组患者临床特征比较详见表1，T-ALL组的FGFR3表达高于B-ALL组，差异有统计学意义(P<0.05)。19 d骨髓原始细胞比例≥5%的患者FGFR3表达升高(P<0.05)。FGFR3表达与患者的性别、年龄、外周血白细胞计数、血小板计数、肝脾肿大及有无髓外浸润等无明显相关性。

2组患者生存曲线如图1所示，FGFR3+组的OS[(34.19±5.09)%]明显低于FGFR3-组[(50.79±4.98)%](P<0.05)。

2 FGFR3表达阳性及阴性患者CECs数量及表面抗原的比较

FGFR3+组CECs数量中位数为1.18×105/L，FGFR3-组CECs数量中位数为6.2×104/L，两者相比有显著性差异(P<0.05)。

ALL患者的CECs均高表达血管内皮细胞特异性抗原CD31、CD144、VEGFR-2和CD146，基本不表达白细胞共同抗原CD45，可被鉴定为血管内皮细胞。而CD133是内皮祖细胞的标志物[9]。与FGFR3-组相比，FGFR3+组CECs表达CD133的阳性率明显升高(P<0.05)；而CECs表面血管内皮细胞标志物CD31、CD144、VEGFR-2和CD146的表达在2组间并无明显变化,见表2。

表1 FGFR3 mRNA表达与各临床指标的关系

Table 1.The relationship between FGFR3 expression and clinicopathologic features in the 44 ALL patients

ClinicalcharactersnFGFR3expressionPositiveNegativePvalueSex Male2811170.196 Female1688Age(year) ≥50209110.234 <50241014WBC(×109/L) ≥509540.207 <50351421PLT(×109/L) ≥403112190.172 <401376Blastsinbonemarrowon19day(%) ≥58620.046 <5361323FABclassification L116790.576 L219811 L3945Immunophenotyping B-ALL3713240.018 T-ALL761hepato-and/orsplenomegaly Yes3315180.243 No1147Extramedullaryinfiltration Yes211 No4218240.502

Figure 1.Comparison of the survival curves between FGFR3+group and FGFR3-group.

图1 FGFR3+与FGFR3-患者生存曲线的比较

表2 FGFR3+与FGFR3-患者CECs表面标志物的变化

*P<0.05vsFGFR3-group.

3 FGFR3+组和FGFR3-组生长曲线的比较

FGFR3+组的细胞数在生长曲线的3个时点上均较FGFR3-组增多(P<0.05)，增殖能力有明显差异。FGFR3-+aFGF组与FGFR3+组相比无显著差异,见图2。

Figure 2.Comparison of the growth curves of CECs. Mean±SD.*P<0.05vsFGFR3-group.

图2 CECs生长曲线的比较

4 FGFR表达水平与CECs集落形成能力的关系

FGFR3+组中，体外培养CECs进行集落形成实验15例，集落形成数目为FGFR3-组的3倍，两者相比有显著差异(P<0.05),见图3。

Figure 3.Comparison of the colony formation of CECs between FGFR3+group and FGFR3-group.*P<0.05vsFGFR3-group.

图3 FGFR3阳性组与阴性组患者CECs集落形成能力的比较

5 FGFR3蛋白在ALL-FGFR3+患者CECs上的表达

19例ALL-FGFR3+患者的CECs表面均可以检测到不同程度的FGFR3蛋白表达，其阳性率为29.00%±15.71%，范围为18%～47%，见图4。

Figure 4.CECs from ALL-FGFR3+patients expressed FGFR3invitro(×200).

图4 ALL-FGFR3+患者体外培养的CECs表面FGFR3阳性表达

讨 论

在核型正常44例ALL中，T-ALL、19 d骨髓原始细胞≥5%的患者FGFR3表达升高，而这些临床指标均提示预后不良，说明FGFR3的高表达与ALL的进展和侵袭有关。随访中发现FGFR3阳性组OS明显下降，进一步提示FGFR3 是预后不良的一个指标。这些结果与文献报道一致，FGFR3作为致癌基因与血液肿瘤的发生、发展密切相关。如将高表达FGFR3的骨髓细胞植入经致死性照射的小鼠体内，所有移植后的小鼠都出现了恶性的血液表型包括淋巴细胞和髓系的恶性表型[10]。

为进一步研究FGFR3 对肿瘤血管增殖的影响，实验中利用免疫磁珠富集CECs,巧妙衔接流式细胞术计数内皮细胞，有效避免了红细胞碎片、血小板及白细胞的污染。分离的细胞呈现铺路石样的典型血管内皮细胞形态[11]，同时高表达CECs的表面抗原CD31、CD144和VEGFR-2[12]。

接下来对CECs生物学性状分析显示，FGFR3阳性组CECs数量明显高于阴性组，CD133阳性的细胞比例升高，体外培养中，其CECs的倍增速度明显高于FGFR3阴性组。这些特征提示了CECs组成的复杂性，其中有群细胞是骨髓来源的内皮祖细胞，它们倍增时间短，增殖能力强，而FGFR3表达的升高伴随着这群细胞数量的增多。集落形成实验的结果也验证了这一点，FGFR3+组CECs的集落能力显著高于FGFR3-组。研究认为仅仅干细胞有形成集落的能力，那么这种增殖能力的获得很可能源于FGFR3的过表达。

FGFR3在FGFR3+患者的CECs上同样表达阳性，进一步提示FGFR3促进肿瘤增殖的作用可能同样表现在CECs上，对CECs增殖产生积极的影响。这在国内外是首次发现，而最新的研究显示FGFR3的过表达在肝细胞肿瘤中有促进肿瘤及肿瘤血管增殖的双重作用[13]。

FGFR3 与配体结合后激活MAPK 等信号转导途径，调节细胞增殖、分化、迁徙和抑制细胞凋亡，类似Ras 途径。但是目前关于FGFR3影响血管增殖的具体机制尚不清楚，有证据表明FGFR3 过度表达或突变能致肿瘤细胞增殖，导致血管内皮生长因子的产生，促进肿瘤血管的生成[14]，因此推测FGFR3作为一个肿瘤相关基因有促进ALL血管增殖的作用，其可能具备了抗肿瘤及抗血管生成的双重靶点身份，可以为今后的分子治疗提供更多的选择。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Expression of FGFR3 in acute lymphoblastic leukemia patients and its contribution to proliferation of circulating endothelial cells

WU Jing-yi1, ZHOU Jian-feng2, PEI Ren-zhi1, ZHANG Pi-sheng1, LIU Xu-hui1, DU Xiao-hong1

(1DepartmentofHematology,YinzhouHospitalAffiliatedtoMedicalSchoolofNingboUniversity,Ningbo315000,China;2DepartmentofHematology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:peirz@163.com)

AIM: To evaluate the expression of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) in acute lymphocytic leukemia (ALL) patients and its contribution to the proliferation of circulating endothelial cells (CECs). METHODS: The mRNA expression levels of FGFR3 in 44 patients with ALL were assayed by RT-PCR. Overall survival (OS) rates of the patients in FGFR3+group and FGFR3-group were estimated by Kaplan-Meier analysis. The CECs were sorted from peripheral blood by magnetic-activated cell sorting and then counted by 3-color flow cytometry. The cell counts, antigen expression, growth curve and colony forming rate of the CECs in the 2 groups were determined. The FGFR3 expression of CECs was identified by immunofluorescence staining. RESULTS: The positive rate of FGFR3 mRNA expression was 43.2% in 44 ALL patients with normal karyotype. T-ALL expressed higher level of FGFR3 than B-ALL (P<0.05). FGFR3 was over-expressed in ALL patients with bone marrow blast proportion ≥5% (P<0.05). The probability of OS was significantly lower in FGFR3+group than that in FGFR3-group (P<0.05). The sorted CECs highly expressed CD31, CD144, VEGFR-2 and CD146, and rarely expressed CD45. The counts of CECs and expression level of CD133 significantly increased in FGFR3+group compared with FGFR3-group. The same result of the amount of colony formation was observed (P<0.05). There was significant difference at 3 time points of cultured CECs countinvitrobetween FGFR3+group and FGFR3-group (P<0.05). The positive rate of FGFR3 expression of CECs from 19 ALL-FGFR3+patients was (29.00±15.71)%. CONCLUSION: The over-expression ofFGFR3 gene in ALL may be helpful to evaluate the prolife-ration of CECs, and become a double target with anti-tumor and anti-angiogenesis effects to offer more choice for molecular therapy in the future.

Acute lymphocytic leukemia; Fibroblast growth factor receptor 3; Circulating endothelial cells

1000- 4718(2017)04- 0694- 05

2016- 09- 12

2016- 12- 05

浙江省自然科学基金资助项目(No. LQ12H08001)； 浙江省卫生厅一般研究项目资助(No. 201235256)； 宁波市自然科学基金资助项目(No. 2012A610236)； 宁波市医学科技计划资助项目(No.2011B23)

R730.23； R733.71

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.019

△通讯作者 Tel： 0574- 87016871； E-mail: peirz@163.com