异丙酚对大鼠大脑功能和TPA、MMP9表达的影响*

王虹又， 陈 萍， 余 娅， 易宗平， 严 艾

(重庆医科大学附属第一医院麻醉科， 重庆 400016)

异丙酚对大鼠大脑功能和TPA、MMP9表达的影响*

王虹又， 陈 萍△， 余 娅， 易宗平， 严 艾

(重庆医科大学附属第一医院麻醉科， 重庆 400016)

目的： 探讨异丙酚对新生大鼠海马组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)表达的影响及其与认知功能的关系。方法: 新生7日龄大鼠随机分为3组：对照(CON)组为连续7 d腹腔注射生理盐水；异丙酚单次麻醉(SP)组为连续腹腔注射生理盐水6 d，第7天注射异丙酚；异丙酚多次麻醉(RP)组为连续7 d腹腔注射异丙酚。各组随机取6只大鼠行血糖和血气监测。于建模后2 h、24 h、48 h、72 h和30 d各组随机取大鼠分离海马组织。其余大鼠喂养至出生后25 d行Morris水迷宫实验，测定其空间学习记忆能力。HE染色及尼氏染色观察海马形态学改变。采用Western blot法检测tPA和MMP9蛋白表达的动态变化，RT-PCR法测定tPA和MMP9的mRNA表达改变。结果: 与CON组相比，RP组各时点大鼠海马tPA和MMP9蛋白表达均呈明显的下降趋势(P<0.05)；而SP组仅24 h 时tPA表达呈下降趋势，其它时点下降趋势不明显，MMP9表达均无明显下降。与CON组相比，24 h时RP组海马tPA及MMP9的mRNA表达明显下调(P<0.05)，而SP组下调不明显。Morris水迷宫实验第3天开始RP组的逃逸潜伏期较CON组和SP组延长(P<0.05)，且RP组在原平台象限的探索时间及穿越原平台所在位置的次数较CON组和SP组减少(P<0.05)，而CON组和SP组之间的差异无统计学显著性。与CON组相比，RP组海马神经细胞数量减少且排列紊乱，神经元内尼氏体明显减少，部分神经元出现变性及坏死。而SP组与CON组相比差异无统计学显著性。结论: 多次异丙酚麻醉可导致新生大鼠远期认知功能障碍，其机制可能与海马tPA及MMP9的表达下调、海马神经元正常形态及功能破坏有关；而单次异丙酚麻醉无此作用。

异丙酚； 组织型纤溶酶原激活物； 基质金属蛋白酶9； 认知功能

临床研究发现2岁前重复接受手术和麻醉的儿童可增加日后注意力缺失及多动症的危险性[1]。动物实验提示异丙酚可影响脑发育高峰期(出生后2周内)大鼠的远期神经认知功能[2]，但其具体机制仍未被证实。另有相关研究发现组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)和基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)参与大脑海马学习与记忆功能[3-5],那么异丙酚影响大脑海马功能是否与tPA和MMP9表达改变相关。本实验通过HE及尼氏染色观察异丙酚对大鼠海马形态结构的影响，通过Morris水迷宫实验测定异丙酚对大鼠认知功能的影响，Western blot及RT-PCR法检测海马tPA和MMP9表达的动态改变，初步探查异丙酚麻醉是否通过影响海马tPA和MMP9表达而干扰新生大鼠远期学习记忆能力。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级7 d龄SD大鼠126只，体重12～16 g，雌雄各半，由重庆医科大学实验动物中心提供 [合格证：SCXK(渝2012-0001)]。

2 试剂与仪器

异丙酚(AstraZeneca)；兔抗大鼠tPA 抗体(Abcam)；兔抗大鼠MMP9抗体(Proteintech)；Trizol试剂盒和逆转录试剂盒(TaKaRa)；血糖分析仪(Roche)；动脉血气分析仪(Abbott)；水迷宫系统(重庆平凡仪器仪表公司)。

3 方法

3.1 动物模型建立 采用随机数字表法分为3组：对照 (control，CON)组：连续7 d腹腔注射生理盐水7.5 mL·kg-1·d-1；异丙酚单次麻醉(single dose of propofol anesthesia，SP)组：前6 d连续腹腔注射生理盐水7.5 mL·kg-1·d-1，第7天腹腔注射异丙酚75 mg/kg；异丙酚多次麻醉(repeated doses of propofol anesthesia，RP)组：连续7 d腹腔注射异丙酚75 mg·kg-1·d-1。每次注射异丙酚后立即将新生大鼠置于保温箱中，于鼠腹部贴婴儿脉搏血氧饱和度探头监测SpO2，待新生大鼠翻正反射恢复后与母鼠同窝饲养，自由饮水与进食。

3.2 血糖和血气分析 第7天注射异丙酚后15 min，每组随机取6只大鼠，左心室穿刺采血120 μL，用动脉血气分析仪测定血气值，血糖分析仪检测血糖。

3.3 Western blot法测定tPA和MMP9蛋白表达的动态变化 于建模后的2 h、24 h、48 h、72 h和30 d(水迷宫测试结束后)各组随机取6只大鼠，腹腔注射20%乌拉坦1.2 g/kg麻醉后断头，冰台上迅速分离左侧海马组织，提取总蛋白，BCA法测定各组的蛋白浓度，取30 μg样品，10%的SDS-PAGE分离，分离后的蛋白湿转至PVDF 膜上，5%的脱脂奶粉封闭2 h，分别加兔抗大鼠tPA抗体(1∶1 000)、兔抗大鼠MMP9抗体(1∶500)和兔抗大鼠β-actin抗体(1∶3 000)，4 ℃孵育过夜后洗膜3次，加山羊抗兔 II 抗(1∶4 000)，37 ℃孵育1 h后充分洗膜3次，采用ECL化学发光法显影，凝胶成像图像分析系统Fusion-FX7 Spectra进行免疫印迹膜的成像与电泳条带的半定量分析。

3.4 RT-PCR法测定tPA和MMP9的mRNA表达 取各组的右侧海马组织，用Trizol试剂盒提取总RNA，按照PCR逆转录试剂盒说明书将各组总RNA逆转录为cDNA。内参照β-actin的上游引物序列为5’-AGATGACCCAGATCATGTTTGA-3’，下游引物序列为5’-TTGGCATAGAGGTCTTTA-3’，扩增片段长度为535 bp；tPA的上游引物序列为5’-AGGCAATCGGGTGGAATACT-3’，下游引物序列为5’-ACTGTAGGGCTTCTGGGACA-3’，扩增片段长度为301 bp；MMP9的上游引物序列为5’-CCCTGCGTATTTCCATTCAT-3’，下游引物序列为5’-AAACCCCACTT CTTGTCAGC-3’，扩增片段长度为302 bp。扩增条件为94 ℃ 5 min； 94 ℃ 15 s， 58 ℃ 30 s， 72 ℃ 45 s，循环30 次；72 ℃ 7 min。用1.5% 琼脂糖凝胶水平电泳鉴定PCR 产物，实验重复6次，用Bio-Rod凝胶成像系统成像并用Quantity One分析软件进行半定量分析。

3.5 认知功能改变的测定 各组剩余12只新生大鼠饲养至出生后25 d开始做水迷宫测试。测试期间，保持每天测定的时段、实验室内物品摆放、灯光等不变，排除外界环境的干扰。前1～5 d进行定位航行实验：每只大鼠每天训练4次(随机从每个象限中点面壁式下水1次)，每次间隔约60 s。图像采集及分析系统会自动记录大鼠60 s内找到平台的逃逸潜伏期。第6天行空间探索实验：将平台撤离，选择与原平台所在象限相对的象限中点为入水点，采用图像采集及分析系统记录大鼠60 s内在原平台所在象限探索的时间和穿越原平台所在位置的次数，反映大鼠的记忆能力。

3.6 海马形态学改变 水迷宫测试结束后各组随机取6只大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后暴露心脏，用生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌注固定后迅速剥离出脑组织，于4 ℃的多聚甲醛中固定48 h，常规脱水、包埋制作成石蜡切片，并进行常规的HE染色及尼氏染色。

4 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。各组内定位航行实验结果比较采用双因素重复测量的方差分析，各组间实验结果比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠血糖和血气分析结果的比较

3组大鼠的血氧饱和度值、血糖值等均在正常范围内，见表1。

表1 3组大鼠动脉血气分析和血糖检测的结果

Table 1.The results of arterial blood gas and blood glucose in the 3 groups (Mean±SD.n=6)

IndexCONSPRPpH7.40±0.027.40±0.037.38±0.02PaCO2(mmHg)40.50±2.7441.00±3.0542.50±2.70PaO2(mmHg)102.40±3.5098.00±1.3098.30±2.30HCO-3(mmol/L)25.30±1.7025.10±1.6024.70±2.00SpO2(%)97.00±1.8096.30±1.5096.70±1.70Glucose(mmol/L)6.70±0.306.60±0.236.70±0.18

2 各组大鼠认知功能的改变

定位航行实验:从水迷宫第3天开始，RP组大鼠寻找平台的时间即逃逸潜伏期明显长于CON组与SP组(P<0.05)，而SP组与CON组相比差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1.The latency to locate the hidden platform in the 3 groups of rats during 5 training days. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图1 3组大鼠在前5 d训练时间中找到隐藏平台的潜伏期比较

空间探索实验：与CON组和SP组相比，RP组大鼠在原平台所在象限探索时间及穿越原平台所在位置的次数明显减少(P<0.05)，而SP组与CON组相比差异无统计学显著性，见图2、3。

Figure 2.The time spent in the target quadrant in the 3 groups of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图2 3组大鼠在目标象限探索时间的比较

3 HE染色观察海马结构的改变

CON组大鼠海马神经细胞数量多且排列紧密整齐，细胞核大而圆，核仁明显。SP组海马神经细胞数量、形态与CON组差异变化不明显。而RP组中海马神经细胞数量减少且排列紊乱，细胞周围间隙变大，部分细胞皱缩呈类三角形，核偏位，胞核及核仁凝聚浓染较明显，部分神经细胞出现变形及坏死等，见图4。

Figure 3.The number of crossing over the previous platform in the 3 groups of the rats. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图3 3组大鼠穿越原平台的次数的比较

Figure 4.HE staining of the hippocampus in the rats with diffe-rent treatments.

图4 3组大鼠海马的HE染色观察

4 尼氏染色观察海马神经元的改变

CON组大鼠海马神经元形态规则，排列整齐，胞质内的尼氏体染色深，数量多。SP组神经元形态结构与CON组无明显差异。RP组海马神经元排列尚整齐，但神经细胞轮廓稍模糊，细胞间隙变宽，胞质内尼氏体明显减少，颜色变浅，部分神经元皱缩，凋亡，染色质凝集，见图5。

Figure 5.Nissl’s staining of the hippocampal neurons in the rats with different treatments (×400).

图5 3组大鼠海马神经元尼氏染色的观察

5 各组大鼠tPA和MMP9蛋白表达的动态变化

与CON组相比， RP组在各时点tPA和MMP9蛋白表达均呈明显降低趋势(P<0.05)， SP组tPA表达仅在24 h呈降低趋势(P<0.05)，而在其它时点与CON组的差异无统计学显著性，SP组MMP9表达在各时点与CON组的差异均无统计学显著性，见图6、7。

Figure 6.The protein expression of tPA at various time points was tested by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图6 Western blot检测tPA蛋白在各时点的表达

6 各组大鼠tPA和MMP9的mRNA表达

RP组与CON组和SP组相比，tPA和MMP9的mRNA表达量明显减少(P<0.05)，而SP组与CON组相比差异无统计学显著性，见图8、9。

讨 论

异丙酚是一种静脉全身麻醉药，主要用于麻醉的诱导、维持以及ICU镇静等。近期研究发现，异丙酚麻醉可抑制发育期大脑海马神经元活力，导致其幼年时期空间学习记忆功能减退[6-7]。本实验形态学观察发现，异丙酚多次麻醉可引起大鼠海马神经元数量明显减少，且神经细胞正常形态改变、排列紊乱，尼氏体减少；而异丙酚单次麻醉对海马神经元无明显的影响。水迷宫结果发现：异丙酚单次麻醉对大鼠学习记忆能力影响不明显。RP组的逃逸潜伏期较CON组和SP组明显延长，穿越原平台次数及原平台象限探索时间较CON组和SP组均明显减少，提示异丙酚多次麻醉确实可导致发育期大鼠远期空间学习记忆能力的下降，且可能与异丙酚破坏海马神经元形态结构有关。本实验中异丙酚麻醉期间监测新生大鼠血气及血糖均在正常范围内，排除低氧及低血糖等内环境紊乱对新生大鼠发育期大脑的影响。

Figure 7.The protein expression of MMP9 at various time points was determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图7 Western blot检测MMP9蛋白在各时点的表达

Figure 8.The mRNA expression of tPA was determined by RT-PCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图8 RT-PCR法检测tPA的mRNA表达

Figure 9.The mRNA expression of MMP9 was determined by RT-PCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsSP.

图9 RT-PCR检测MMP9的mRNA表达

异丙酚影响发育期大脑神经功能的机制包括，GABA受体激活后引起神经元胞质内Ca2+的过度增加[8]；神经系统内部和外部凋亡途径的激活[9]；发育期脑神经生长所需营养因子的平衡破坏[10]等。tPA广泛存在于中枢神经系统中，是一种重要的神经调节的介质，在大脑海马学习记忆功能中发挥着重要的作用[11]。Madani等[12]研究证实，过表达tPA的转基因小鼠海马长时程增强(long-term potentiation, LTP)增加且延长，空间定位实验中学习能力提高。Calabresi等[13]研究指出，基因敲除tPA的小鼠海马LTP减少且出现异常的学习与记忆能力。本实验中Western blot及RT-PCR检测结果显示，与CON组相比，SP组的tPA蛋白表达仅于24 h呈一过性降低，而于其它时点并无明显降低改变，并且其mRNA表达也无明显降低，这与水迷宫结果基本一致，提示异丙酚单次麻醉对大脑认知功能的影响较轻微。与CON组和SP组相比，RP组的tPA蛋白表达于各时点均呈明显下降趋势,提示异丙酚多次麻醉影响大脑认知功能很可能与海马tPA蛋白表达明显下降有关；另外RP组tPA的mRNA表达也呈明显的下降趋势，说明异丙酚多次麻醉后不仅影响tPA的蛋白表达，同时也抑制了其基因的转录。

MMP9是MMPs家族中的成员——明胶酶B，主要水解变性胶原以及基膜的主要成分IV型胶原。Nagy等[5]运用海马体脑片证实在LTP形成过程中MMP9被迅速激活，MMP9基因敲除后可抑制长时程增强晚时相(L-LTP)的诱导生成；当加入外源性有活性的MMP9到MMP9基因敲除脑片中可逆转LTP的抑制，从而证实MMP9在海马体L-LTP形成中发挥着重要的作用，影响并调节着海马体相关突触形成以及长时程学习记忆。本实验中Western blot结果发现，与CON组相比，RP组中各时点海马MMP9蛋白表达均呈明显下降，而SP组仅在48 h MMP9表达有所下降；RT-PCR结果亦发现：RP组与CON组和SP组相比MMP9 mRNA表达明显降低，而SP组与CON组相比差异无统计学意义，提示异丙酚多次麻醉可明显降低海马MMP9蛋白及基因的表达，而异丙酚单次麻醉对海马MMP9表达影响不显著。综上分析可知异丙酚多次麻醉引起的大鼠学习记忆能力下降很可能与海马学习记忆相关的tPA及MMP9表达明显降低有关。

综上所述，异丙酚多次麻醉明显抑制大鼠海马tPA和MMP9表达，破坏海马神经元正常形态及功能，可能是其影响新生大鼠远期学习记忆能力的机制之一。而异丙酚单次麻醉对此影响较轻微。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effects of propofol on rat brain function and tPA/MMP9 expression

WANG Hong-you, CHEN Ping, YU Ya, YI Zong-ping, YAN Ai

(DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:mazuichen@163.com)

AIM: To investigate the effects of propofol on the expression of tissue-type plasminogen activator (tPA) and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) in the hippocampus and the cognitive function in neonatal rats. METHODS: The 7-day-old rats were randomly divided into 3 groups: the rats in control (CON) group were intraperitoneally injected with normal saline for 7 d; the rats in single dose of propofol anesthesia (SP) group were intraperitoneally injected with normal saline for 6 d and with propofol on the 7th day; the rats in repeated dose of propofol anesthesia (RP) group were intraperitoneally injected with propofol for 7 d. Blood glucose and blood gas analysis were tested in 6 rats of each group. The rats were randomly selected from each group to isolate the hippocampal tissues at 2 h, 24 h, 48 h, 72 h and 30 d after the last injection. The spatial learning and memory functions of the other rats aged 25 d were determined by Morris water maze. The morphological changes of the hippocampus were observed by HE staining and Nissl’s staining. The expression of tPA and MMP9 at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot. RESULTS: Compared with group CON, the protein expression of tPA and MMP9 in RP group was significantly decreased at each time point, while no significant decrease was observed in SP group except at the time point of 24 h. Compared with CON group, the mRNA expression of tPA and MMP9 was down-regulated obviously in RP group, which was not significantly down-regulated in SP group. From the 3rd training day of Morris water maze beginning, the escape latency was prolonged, and the space exploration time and the number of crossing the original platform location were reduced in RP group compared with CON group and SP group, while no significant difference was observed between CON group and SP group. Compared with CON group, the number of nerve cells reduced and nerve cells arranged in disorder in the hippocampus in RP group. Moreover, the number of Nissl body decreased significantly and finally developed into neuronal degeneration and necrosis in RP group, and no significant difference between SP group and CON group was observed. CONCLUSION: Repeated dose of propofol anesthesia leads to long-term cognitive dysfunction in neonatal rats, which may be related to the down-regulation of tPA and MMP9 expression and destruction of normal morphology and function of neurons in hippocampus, whereas single dose of propofol anesthesia has no such effects．

Propofol; Tissue-type plasminogen activator; Matrix metalloproteinases 9; Cognitive function

1000- 4718(2017)04- 0717- 06

2016- 10- 24

2016- 12- 22

卫生部国家临床重点专科建设项目[财社(2011)170号]； 重庆市卫生局医学科研计划(No. 2012-1-018)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.023

△通讯作者 Tel: 023-89011069； E-mail: mazuichen@163.com