亚甲蓝减轻大鼠离体心脏缺血/再灌注引起的线粒体损伤*

盛 琼， 翁 平， 张晓彤， 田文芳， 陈俊良， 苑佳佳， 陈新杰， 庞庆丰

(江南大学无锡医学院， 江苏 无锡 214122)

亚甲蓝减轻大鼠离体心脏缺血/再灌注引起的线粒体损伤*

盛 琼， 翁 平， 张晓彤， 田文芳， 陈俊良， 苑佳佳， 陈新杰， 庞庆丰△

(江南大学无锡医学院， 江苏 无锡 214122)

目的： 探讨亚甲蓝(methylene blue, MB)对大鼠离体心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)线粒体损伤的作用。方法：将Spragure-Dawley大鼠随机分为对照组(control组)、I/R模型组和MB治疗组(I/R+MB组)，建立Langendorff离体心脏灌注模型(n=6)。手术前2 h，MB组大鼠按2 mg/kg腹腔注射MB。对照组持续灌注K-H液110 min，I/R组与I/R+MB组平衡灌注20 min后停灌30 min，再灌注60 min。实时记录心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室最大压力变化速率(±dp/dtmax)和左室舒张末压(LVEDP)。测定冠脉流出液中肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。测定心肌组织中活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)和三磷酸腺苷(ATP)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性。苏木精-伊红染色观察组织病理学变化。分离心肌组织线粒体，测定线粒体肿胀程度和线粒体膜电位(MMP)。结果：与对照组相比，I/R组的心功能恶化，冠脉流出液中的CK-MB和LDH活性升高，心肌组织中的ROS和MDA增加，SOD活性降低，ATP减少，线粒体肿胀程度升高，MMP下降(P<0.05)；与I/R组相比，I/R+MB组的心功能改善，CK-MB和LDH的释放减少，组织中的ROS和MDA减少，SOD活性和ATP含量升高，线粒体肿胀程度降低，MMP升高(P<0.05)。结论：MB通过减轻线粒体损伤对大鼠离体I/R心脏发挥保护作用。

亚甲蓝； 离体心脏； 缺血/再灌注； 线粒体

随着现代医学的不断发展，如心脏移植、动脉搭桥术、溶栓疗法、心肌梗塞后再通、经皮腔内冠脉血管成形术、心肺脑复苏术和体外循环心脏外科手术，均会发生心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[1]。因此，寻找理想的治疗药物是防治手术中心肌I/R损伤的重要工作。

目前研发的抗氧化剂清除氧自由基的能力不断增强，但临床使用效果并不理想。寻找新的抗氧化损伤措施是防治心肌I/R损伤的紧要任务。强抗氧化剂的抗氧化能力越强，其氧化还原电位越低，一般均在-0.4 V与-0.2 V之间。一旦强抗氧化剂从线粒体复合体I获取电子后，不容易向呼吸链中的铁硫蛋白、泛醌、细胞色素b、细胞色素C等电子传递体释放电子，电子传递活动停止，氧化磷酸化过程障碍，ATP合成不足，无法对抗氧化应激造成的组织损伤[2]。亚甲蓝(methylene blue, MB)的氧化还原电位仅为10 mV，接近于零，属于弱抗氧化剂，在临床上广泛用于亚硝酸盐及苯胺类和氰化物引起的中毒。本课题组发现MB通过其抗氧化特性减轻百草枯中毒引起的大鼠肝损伤[3]。近来研究表明，MB通过增加细胞色素C氧化酶的活性，促进ATP产生，对缺血造成的损伤的脑组织发挥保护作用[4-5]；MB通过增强组织抗氧化能力减轻大鼠肾I/R损伤[6]；MB能够减轻肠I/R引起的肝脏线粒体功能障碍[7]；然而，MB对I/R心脏的保护作用尚未见相关报道。因此，本文拟研究MB对离体心脏I/R的作用及其机制。

材 料 和 方 法

1 材料

清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠，体重250～300 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号为2015000505720。PowerLab/8SP离体心脏灌流系统(ADInstruments)。肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase-MB isoenzyme, CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；组织线粒体分离试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；显微镜(Olympus)；亚甲蓝(江苏济川药业集团)。K-H液(mmol/L)：NaCl 118.5, NaHCO324.8, D-glucose 11, KCl 4.7, MgSO41.2, KH2PO41.2, CaCl22.25, pH 7.4。

2 方法

2.1 实验分组与模型建立 SD雄性大鼠18只，随机分为3组，每组6只：(1)正常对照组(control组), 持续灌流K-H液110 min；(2)缺血再灌注组(I/R组), K-H液平衡灌流20 min后，37 ℃全心停灌30 min，再灌注60 min；(3)MB 处理组(I/R+MB组)，大鼠于手术前2 h腹腔注射溶解于生理盐水、浓度为1 g/L的MB (2 mg/kg)[3]，K-H液平衡灌流20 min后，37 ℃全心停灌30 min，再灌注60 min。

3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉SD雄性大鼠；开胸后迅速摘取心脏放入冰水混合状态的K-H液中使心脏骤停，经主动脉将心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，用K-H液恒温37 ℃逆行灌流，灌流液通95% O2、5% CO2混合气体。将一球囊插入左心室，球囊与压力转换器连接，通过生物信号采集处理系统，连续记录左心室收缩功能曲线，记录左心室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)，左心室舒张末压(left ventricle end-diastolic pressure，LVEDP)，左心室最大压力变化速率(left ventricular pressure maximum change rate，±dp/dtmax)和心率(heart rate，HR)等指标。

2.2 病理组织切片 实验结束后，4%甲醛固定心脏组织，常规石蜡包埋、制片、苏木素-伊红(HE)染色。

2.3 冠脉流出液中CK-MB及LDH活性检测 收集再灌注末冠脉流出液，按照试剂盒说明检测冠脉流出液中CK-MB和LDH的活性。

2.4 心肌组织生化指标测定 取灌流后的心肌组织，按照MDA、ATP和SOD试剂盒说明，测定各实验组心脏组织中MDA和ATP含量以及SOD活性。

2.5 心肌组织ROS水平的检测 心肌组织制成5%的匀浆，1 000×g离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度。测定孔取190 μL上清液加入 1 mmol/L DCFH-DA工作液10 μL，对照孔取190 μL上清液加入PBS 10 μL，37 ℃孵育30 min，分别选取485 nm和525 nm作为激发波长和发射波长测定其荧光强度。

2.6 线粒体肿胀程度 取灌流后心肌组织，按照组织线粒体分离试剂盒说明，分离心肌组织线粒体，线粒体置于重悬液中；配制线粒体肿胀液(mmol/L)：sucrose 125, KCl 50, KH2PO42, HEPES 10, pH 7.4。用线粒体肿胀液稀释分离出的线粒体至蛋白浓度为0.5 g/L，加入200 μmol/L CaCl2，30 ℃条件下用紫外分光光度计检测540 nm处的吸光度，持续记录10 min。吸光度的下降反映线粒体肿胀程度[8]。

2.7 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)检测 配制膜电位缓冲液(mmol/L)：甘露醇 225, 蔗糖70, HEPES 5, KH2PO44, MgCl22, Rh123 3×10-4, pH 7.2。心肌线粒体加入2 mL膜电位缓冲液，使线粒体蛋白终浓度为0.5 g/L，调整荧光分光光度计为激发波长503 nm, 发射波长525 nm。加入40 μmol/L CaCl2诱导Rh123释放。记录荧光值[9]。

3 统计学处理

使用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 左心室血流动力学记录

再灌注30 min和60 min时，与对照组相比，I/R组的LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax显著降低，LVEDP显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与I/R组相比，I/R+MB组的LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax显著增加，而LVEDP显著减少(P<0.05)，见表1。

表1 左心室血液动力学

*P<0.05vsbaseline；△P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsI/R group.

2 心脏组织病理学改变

对照组的心肌细胞排列整齐，心肌横纹比较清晰；I/R组的心肌纤维排列紊乱，心肌有断裂，核碎裂、消失，胞质均质红染及呈不规则粗颗粒状，间质水肿，心肌纤维间可见大量炎细胞浸润；I/R+MB组的心肌细胞损伤较I/R组明显减轻，见图1。

Figure 1.The effects of methylene blue (MB) on the histopathological changes of heart tissues after I/R (HE staining, ×400).

图1 各组大鼠离体心脏病理学改变

3 冠脉流出液及心肌组织中生化指标水平

同对照组相比，I/R组冠脉流出液中的CK-MB和LDH活性显著增加，心肌组织中的ROS和MDA含量增加，SOD活性降低(P<0.05)。与I/R相比，I/R+MB组流出液中的CK-MB和LDH活性显著降低(P<0.05)，心肌组织中的ROS和MDA产生较I/R组显著减少，SOD活性显著增加(P<0.05)，见表2。

表2 MB对离体心脏I/R模型生化指标的影响

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

4 线粒体肿胀程度、MMP和ATP含量

与对照组相比，I/R组的吸光度变化值增大(P<0.05)，I/R+MB组与I/R组相比，吸光度变化减少(P<0.05)。该结果提示I/R可引起线粒体肿胀，而MB能减轻了线粒体肿胀，见图2。与对照组相比，I/R组MMP降低，ATP生成减少(P<0.05)。I/R+MB组与I/R组相比，MMP显著增加，ATP生成增加(P<0.05)，见图3、4。

Figure 2.The effect of methylene blue (MB) on the mitochondrial swelling levels in the rat heart tissues after I/R. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

图2 I/R后大鼠心脏组织中线粒体肿胀程度变化

讨 论

与其他研究各种强还原剂对I/R心脏的保护作用不同，本研究首次探讨了弱还原剂MB对大鼠离体I/R心脏的保护作用，获得主要研究结果如下：(1)MB能有效减轻I/R大鼠离体心脏的血流动力学异常以及形态学变化；(2)MB能够减轻心肌组织中MDA含量，增加SOD活性；(3)MB能够抑制线粒体肿胀，恢复线粒体膜电位，促进线粒体ATP生成。这些结果提示MB能够通过增强线粒体的功能，降低离体心脏的I/R损伤。

Figure 3.The effect of methylene blue (MB) on the changes of MMP in the rat heart tissues after I/R. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

图3 I/R后大鼠心脏组织中MMP变化

Figure 4.The effect of methylene blue (MB) on the change of ATP contents in the rat heart tissues after I/R. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group.

图4 I/R后大鼠心脏组织中ATP含量变化

线粒体损伤是心脏I/R发生的关键机制[10]，而抗氧化剂是治疗心脏I/R的关键药物[11]。但目前研发的抗氧化剂尚不能有效治疗心脏的I/R损伤。超氧化物歧化酶和过氧化物酶因无法穿过生物膜而作用受限[12]。抗氧化药物维生素C因加速羟自由基的产生，有可能反而加重氧化损伤[13]。MB作为一种小分子，容易通过生物膜，可以快速地发挥药效[14]。以往研究认为MB是鸟苷酸环化酶竞争性抑制剂，通过作用于NO/cGMP通路减轻心脏I/R[15]。本研究发现MB能够通过减轻线粒体损伤而减轻心脏I/R损伤，可能揭示了MB减轻心脏I/R损伤的新机制。

心功能是反映I/R损伤程度的重要指标。本实验通过离体心脏Langendorff灌注模型，观测MB对I/R的大鼠离体心脏的血流动力学以及心肌酶的影响。实验结果表明：同对照组相比，I/R组大鼠离体心脏再灌注期的±dp/dtmax绝对值和LVDP显著减少，而LVEDP显著增加，说明I/R损伤模型成功。MB能够减轻I/R导致的心脏损伤，使再灌注期±dp/dtmax的绝对值和LVDP显著增加，LVEDP显著降低，提示MB能够有效改善I/R导致的心功能障碍。病理形态学检查也发现MB可以减轻I/R导致的形态学异常。

心肌I/R导致线粒体功能严重障碍，主要表现有线粒体肿胀、MMP降低和ATP生成减少[16]。本实验结果表明MB可有效地增加I/R心肌细胞线粒体中ATP的生成；同时降低线粒体肿胀程度和维持MMP。这些结果提示MB对心肌I/R的线粒体损伤有理想的对抗作用。

心肌I/R可以导致心肌细胞膜损伤，出现细胞膜完整性破坏、通透性增加、大量心肌酶外漏等病理过程。心肌酶CK-MB是反映心肌细胞受损程度的重要指标[17]。本实验结果表明MB可以减少I/R引起的心肌组织中CK-MB的外漏，提示MB可以减轻I/R时心肌细胞的破坏，保护心肌组织。

大量研究表明，心脏I/R时会导致心肌细胞内大量的氧自由基产生，引发脂质过氧化，产生MDA。MDA破坏细胞膜，使得大量Ca2+内流，细胞内Ca2+超载，引起细胞结构损伤，甚至引起细胞死亡[18]。因此，MDA的含量变化可间接反映细胞受自由基损伤的破坏程度。SOD是生物体内清除自由基的重要物质，其活性变化也可间接反映机体对氧自由基的清除能力。本实验结果表明I/R组心肌组织中的MDA含量增加，而SOD活性降低。而与I/R组相比，I/R+MB组的心肌组织中的MDA含量降低，SOD活性增加。说明心脏I/R导致大量自由基产生，引起心肌损伤；MB可以加快氧自由基的清除，减少脂质过氧化作用达到心肌保护的效果。

总之，本研究发现MB通过减轻线粒体损伤对大鼠离体I/R心脏发挥保护作用。本实验结果可能为防治心肌I/R损伤提供一种新的、有效的方法。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Protective effects of methylene blue on ischemia/reperfusion-induced mitochondrial injury in isolated rat hearts

SHENG Qiong, WENG Ping, ZHANG Xiao-tong, TIAN Wen-fang, CHEN Jun-liang, YUAN Jia-jia, CHEN Xin-jie, PANG Qing-feng

(WuxiMedicalSchool,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China.E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn)

AIM: To study the effects of methylene blue (MB) on myocardial ischemia/reperfusion (I/R)-induced mitochondrial injury in isolated rat hearts. METHODS: Spragure-Dawley (SD) rats were divided into 3 groups randomly (n=6): control group, I/R model group and MB treatment group (IR+MB group). The isolated rat hearts were prepared and set up to Langendorff perfusion. The rats in I/R+MB group received MB (2 mg/kg) by intraperitoneal injection 2 h before operation. The hearts in control group were perfused with K-H solution for 110 min consecutively. The hearts in I/R group and I/R+MB group were in equilibrium for 20 min, following by 45 min of global ischemia, and then reperfused for 60 min. The heart rate (HR), left ventricular developed pressure (LVDP), left ventricular pressure maximum change rate (±dp/dtmax) and left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) were recorded. The perfusate was collected to determine the activity of creatine kinase-MB (CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH). The contents of reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) and adenosine triphosphate (ATP), and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the myocardial tissues were all determined. Histopathological examination of left ventricle was performed. The mitochondria from the heart tissues was isolated and the mitochondrial swelling and mitochondrial membrane potential (MMP) were analyzed. RESULTS: Compared with control group, the hearts in I/R group showed poorer function, higher CK-MB and LDH levels in the perfusate, increased ROS and MDA contents， higher SOD activity and less ATP content in the heart tissues (P<0.05). Furthermore, the mitochondrial swelling level increased and MMP reduced in I/R group (P<0.05). Compared to I/R group, MB improved heart function and reduced the release of CK-MB and LDH (P<0.05). MB also decreased ROS and MDA contents, and increased the activity of SOD and the content of ATP (P<0.05). In addition, MB alleviated mitochondrial swelling and restored the reduced MMP (P<0.05). CONCLUSION: MB protects the isolated rat hearts from I/R-induced injury by attenuating the damage of mitochondria.

Methylene blue; Isolated heart; Ischemia/reperfusion; Mitochondria

1000- 4718(2017)04- 0711- 06

2016- 11- 01

2017- 02- 13

国家自然科学基金资助项目(No. 81270126)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(No. JUSRP51412B)； 江苏省研究生培养创新工程项目(No. KYZZ16_0312； No. KYLX15_1196)；国家级大学生创新创业训练计划项目(No. 201610295074)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.022

△通讯作者 Tel： 0510-85328363； E-mail: qfpang@jiangnan.edu.cn