左金方体内外抑制幽门螺杆菌的实验研究

余惠旻，侯梅轩，林敬斌，周禹练，黎莹斯，陈永恒

(深圳大学医学院，广东 深圳 518060)

左金方体内外抑制幽门螺杆菌的实验研究

余惠旻，侯梅轩，林敬斌，周禹练，黎莹斯，陈永恒

(深圳大学医学院，广东 深圳 518060)

目的：探讨左金方在体内外抑制幽门螺杆菌(hlicobacter pylori，Hp)生长繁殖的作用。方法：采用琼脂稀释法测定左金方和克拉霉素对Hp最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。60只BALB/c小鼠雌雄各半，按体质量分层随机分为正常组、模型组、胃三联组(0.351 mg·g-1)及左金方低、中、高剂量组(0.364，0.728，1.456 g·kg-1·d-1)6组，采用抗生素加Hp的方法连续灌胃7 d建立Hp感染动物模型。从第11天开始连续灌胃给药8周后处死小鼠，进行血清尿素酶抗体检测以及病理切片检查。结果：琼脂稀释法测得左金方最小MIC值为200 μg· mL-1,克拉霉素最小MIC值为0.5 μg· mL-1。血清幽门螺杆菌抗体检测、小鼠胃黏膜病理切片结果均提示Hp感染动物模型复制成功，与正常对照组比较差异有统计学意义。胃三联组、左金方高、中、低剂量组均能有效抑制体内 Hp的生长，与模型对照组比较差异有统计学意义。结论：左金方在体内体外均能有效地抑制幽门螺杆菌的生长。

左金方；幽门螺杆菌；最小抑菌浓度；抑菌

幽门螺杆菌(hpylori，Hp)是全球范围内高感染率的慢性感染性致病菌[1]，近年来发现Hp感染者可发展为慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌，是极其重要的始动因素[2-3]。目前临床以2种抗生素加质子泵抑制剂为治疗Hp的首选药物，但是随着抗生素的广泛使用，Hp耐药菌株不断出现以及抗生素相关不良反应等问题，Hp根治难度越来越大。因此，研究新的抗Hp药物已成为一项重要的研究课题。左金方由黄连和吴茱萸按6∶1组成，对消化系统有广泛的药理作用。现代药理研究表明，左金方有抗溃疡、保护胃黏膜、抑制胃酸分泌、抑菌、止痛和影响胃肠运动的作用[4]。本研究旨在观察左金方体内外抑制幽门螺杆菌生长的情况，为Hp感染相关消化系统疾病的治疗提供一定的实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

三气培养箱(美国THERMO公司)；生物安全柜(新加坡ESCO公司)；LEICA ASP 3005脱水机、EG1150 H石蜡包埋机、LEICA RM2235石蜡切片机、LEICA ST5010 自动染色机(德国LEICA公司)，PHY-Ⅲ型摊烘烤片机(中国江苏常州市中威医疗器械有限公司)，Olympus IX-81 型病理图像采集系统(日本OLYMPUS公司),Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统(美国Medica Cybernetics公司)。

1.2 主要药物与试剂

黄连、吴茱萸均购自深圳华辉药业有限公司，由深圳市中医院中药科刘志承主任药师鉴定，分别为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch．的干燥根茎和芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss)Benth．干燥近成熟的果实[5]；枸橼酸铋钾片/替硝唑片/克拉霉素片(丽珠集团丽珠制药厂，批号160903)；克拉霉素缓释胶囊(广州柏赛罗药业有限公司，批号514)；幽门螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒(北京康美天鸿生物科技有限公司)；BRAIN HEART INFUSION (CM1135,美国OXOID公司)；CAMPYLOBACTER AGAR BASE (Karmali)(CM0935,美国OXOID公司)。

1.3 细菌与动物

幽门螺杆菌采用SSI(Sydney strain 1)菌株，培养液由广州中医药大学中药药理室提供。SPF级Balb/c 小鼠雌雄各半，体质量18～20 g，由广东省医学实验动物中心提供(动物许可证号SCXK(粤)2013-0002)。

2 方法

2.1 药物制备

左金方传统汤剂冻干粉由本实验室提供，取黄连30 g、吴茱萸5 g加8倍蒸馏水浸泡30 min，加水煎煮3 次，每次30 min 过滤，合并3次滤液冷冻干燥，每克干粉含生药3.98 g。经HPLC 法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85%，巴马汀9.19%，药根碱4.86%，吴茱萸碱0.17%，吴茱萸次碱0.19%。将左金方冻干粉溶于去离子水中配置成1 mg· mL-1的母液，实验时用超纯水稀释成所需浓度[6-7]。

克拉霉素的配制方法：取适量克拉霉素缓释胶囊加超纯水液配制成2 μg· mL-1母液，实验时用超纯水稀释成所需浓度。胃三联溶液的配制方法: 取适量枸橼酸铋钾片/替硝唑片/克拉霉素片加超纯水液配制成35.1 mg· mL-1母液，实验时用超纯水稀释成所需浓度。

2.2 幽门螺杆菌的培养

取幽门螺杆菌液100 μL，用一次性涂布器涂于CAMPYLOBACTER AGAR BASE培养基上，置三气培养箱中(85% N2，10% CO2，5% O2)培养，48 h后刮取细菌重悬于PBS缓冲液中，于麦氏比浊仪中调整至适宜实验的菌液浓度。

2.3 琼脂稀释法测定药物最小抑菌浓度

按照美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)制定的琼脂稀释法进行药敏试验。用CAMPYLOBACTER AGAR BASE培养基将左金方倍比稀释成终浓度为500、400、300、200、100 μg · mL-1制备成含不同浓度中药的血琼脂平皿，同时以空白不含中药的培养基作为对照。按2、1、0.5、0.25、0.125 μg · mL-1的克拉霉素终浓度制备H．pylori血琼脂平皿。取100 μL浓度约为 3×108CFU· mL-1的H．pylori 对数期菌液，均匀涂布于制备好的培养基上，重复3块培养基，于85%N2·10%CO2和5%O2、相对湿度95%、37℃条件下培养48～72 h，观察细菌生长情况，以不出现菌落平皿上的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

2.4 造模方法

采用培养48～72 h的SS1菌株，PBS调整浓度到1×109CFU· mL-1，小鼠禁食不禁水24 h后，除空白组外其余小鼠均先用5%碳酸氢钠溶液0.2 mL灌胃，30 min后按照每次0.2 Ml每只的剂量灌胃Hp菌液，连续4次，每次间隔48 h，空白对照组小鼠灌胃等量生理盐水。于末次接种后第4周时禁食12 h处死小鼠，取2块胃窦组织经石蜡包埋，切片后经硼酸美兰(Boricacid methyl blue, BAMB)染色，进行病理组织学检测；另一块匀浆稀释后进行Hp培养，培养后将可疑的菌落格兰染色具有典型特征且触酶实验、氧化酶实验以及尿素酶实验阳性者判定为Hp感染，其中有2项阳性者说明造模成功[8]。

2.5 分组与给药

取 Balb/c 小鼠(SPF级)，按性别体质量随机取10只为空白对照组，其余小鼠接种Hp造模，造模成功后按性别随机分为模型组、胃三联组(0.351 mg· g-1)、左金方高剂量组(1.456 g·kg-1·d-1)、左金方中剂量组(0.728 g·kg-1·d-1)、左金方低剂量组(0.364 g·kg-1·d-1)各10只，雌雄各半，各组小鼠开始灌胃给药，正常对照组和模型组给予等量生理盐水，每次0.3 mL，每日1次，连续8周。

2.6 血清尿素酶检测方法

于末次给药后禁食 24 h，眼眶取血并离心取血清，检测幽门螺杆菌尿素酶抗体(根据试剂盒说明书方法进行)。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 左金方体外抗菌实验

表1显示，肉眼观察左金方血琼脂平皿中，含药浓度在100 μg · mL-1以下时，均可见幽门螺杆菌的生长，含药浓度在500、400、300、200 μg · mL-1时，均未见幽门螺杆菌的生长，可见左金方对Hp的MIC为200 μg· mL-1，相同条件下阳性药物克拉霉素的MIC为0.5 μg· mL-1。

3.2 血清尿素酶检测

表2显示，血清幽门螺杆菌尿素酶抗体检测结果显示，与正常对照组比较，模型组 Hp感染的阳性率为80%，差异有统计学意义(P<0.01)，说明模型复制成功；胃三联组明显降低了Hp的感染率，Hp感染的阳性率降为20%，差异有统计学意义(P<0.01)；左金方低剂量组与高剂量组对幽门螺杆菌的感染均有一定的抑制作用，其中高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，低剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 左金方体外对Hp的抑菌效果

注：+：代表有细菌生长；-：代表无细菌生长

表2 左金方抑制幽门螺杆菌的作用[例(%)]

注：与模型对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

3.3 胃黏膜病理组织学观察结果

胃组织经硼酸美兰(boricacid methyl blue, BAMB)染色后，在光镜下观察，幽门螺杆菌为蓝色，红细胞绿色，背景蓝色。 Hp形状弯曲或棒杆状，主要位于胃腺小凹表面和黏液内。正常对照组胃小凹内未见 Hp，感染率为 0(见图 1A)；模型组及有Hp阳性感染组胃小凹黏液内见深蓝色的 Hp(见图1B)；模型组感染率为100%；阳性药物组清除率为100%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；左金方高、中、低剂量组对Hp感染均有不同程度的抑制作用，其中左金方高剂量组清除率为80%，胃小凹内见少量 Hp黏附，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；左金方低剂量组清除率为50%，胃小凹内见较多Hp黏附，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 幽门螺杆菌在体清除实验结果(胃黏膜组织Hp检测)

注：与对照组比较：#P<0.01；与模型对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

图1 小鼠胃黏膜切片(1000伊)A. 未感染 B. 感染

4 讨论

幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎的主要病原体，它与胃溃疡和胃癌的发生密切相关，是目前惟一公认的细菌致癌因子。研究发现，Hp感染还与消化道外的多种疾病，如冠心病、动脉硬化、脑梗塞、高血压、缺铁性贫血、原发性血小板减少性紫癜等有关。

研究证实，根除幽门螺杆菌后可明显降低和防止消化性溃疡的复发。临床常用抗菌药物(有阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素等)、质子泵制剂(奥美拉挫等)和铋剂等对抗Hp感染。由于Hp的自发突变和不合理使用或滥用抗生素等原因，使耐药菌株不断增加，导致疗效不稳定、药物副作用较大等后果，因此寻找新的对抗Hp感染的有效药物成为亟待解决的关键问题[9]。

应用中药治疗细菌感染具有效果稳定、不易发生耐药性、易在胃内发挥作用等优势，在抗Hp感染中不断被开发应用[10]。左金方重用黄连为君药，清泻肝火，肝火得清，自不横逆犯胃。且黄连泻胃热，使胃火降而和胃气，清泻肝胃之火，标本兼顾。方中配吴茱萸辛热反佐黄连之寒，是泻火而无凉遏之弊，两药相反相成，使肝火得清、胃气得降则诸症自愈[11]。

本实验采用琼脂稀释法测定左金方抑制幽门螺杆菌生长的最小浓度为200 μg· mL-1，证明左金方在体外具有抑制Hp生长的作用；通过建立 Hp体内感染模型，给动物灌服左金方药物，发现左金方高、中、低剂量组对Hp感染均有不同程度的抑制作用。与模型组比较，左金方高剂量组清除率为80%，差异有统计学意义(P<0.01)；左金方低剂量组清除率为50%，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明，左金方在体内外均有抑制幽门螺杆菌生长的作用。

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Antimicrobial Activities of ZuoJinFang against Helicobacter Pylori in Vivo and in Vitro

YU Hui-min, HOU Mei-xuan, LIN Jing-bin, ZHOU Yu-lian，LI Ying-si, CHEN Yong-heng

(SchoolofMedicine，ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Objective： To study the antimicrobial activities of ZuoJinFang against helicobacter pylori in vivo and in vitro. Methods：The minimum inhibiting concentration (MIC) of ZuoJinFang and Clarthromycin were measured by agar dilution method; sixty BALB/c mice, half male and half female, were randomly divided into 6 groups, normal control group，model group，gastric triad group (0.351 mg· g-1) and ZuoJinFang low, middle and high dose groups (0.364，0.728，1.456 g· kg-1· d-1), the mice were inoculated orally with antibiotic on first day and with Helicobacter pylori strains for 7 continuous days to establish Hp infection model. From experimental day 11，the mice were given oral administration of the corresponding drugs for 8 weeks. At the end of the experiment，gastric mucosa and serum were obtained for serum HP antibody test and pathological section examination. Results The MIC of ZuoJinFang was confirmed as 200 μg· mL-1and that of Clarthromycin was 0.5 μg· mL-1. The result of serum antibody test and pathological section examination showed that Hp infection model had been established successfully，compared with the normal control, were statistically significant. And both gastric triad group and ZuoJinFang could inhibit the growth of Hp in vivo, compared with the model group，were statistically significant.Conclusion：ZuoJinFang are effective on inhibiting the growth of Hp in vivo and in vitro.

ZuoJinFang； Helicobacter pylori； Minimum inhibitory concentration； Antimicrobial activities in vitro and in vivo

余惠旻(1972-)，男，新疆人，药学博士，从事中药及其复方与机体微生态的研究。

R589

B

1006-3250(2017)03-0405-03

2016-09-15