反相高效液相色谱法同时测定黄酒中4种游离嘌呤

刘镇，王灵芝，章姗姗，葛乐勇，诸葛庆，曾红燕

（绍兴市食品药品检验研究院，国家黄酒产品质量监督检验中心，浙江绍兴312000）

反相高效液相色谱法同时测定黄酒中4种游离嘌呤

刘镇，王灵芝，章姗姗，葛乐勇，诸葛庆，曾红燕

（绍兴市食品药品检验研究院，国家黄酒产品质量监督检验中心，浙江绍兴312000）

建立了一种简单、快捷的黄酒中4种游离嘌呤含量的高效液相色谱分析方法。在0.5～20mg/L浓度范围内，各嘌呤的响应值与其相应浓度呈良好线性关系，相关系数大于0.9990，相对标准偏差在0.8%～1.5%，检出限在0.02～0.17mg/L，加标回收率在89%～105%，符合分析测试要求。实验黄酒中游离腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤及黄嘌呤的含量分别为4.30mg/L、1.29mg/L、2.93mg/L与3.92mg/L。

嘌呤；黄酒；高效液相色谱

嘌呤是一种生物碱，由一个嘧啶环和一个咪唑环稠合而成，主要包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤及其衍生物等。在人体内嘌呤代谢会变成尿酸，其中黄嘌呤是尿酸的直接来源，而次黄嘌呤和鸟嘌呤是尿酸的间接来源，二者均是在黄嘌呤氧化酶的作用下被氧化为黄嘌呤，最后黄嘌呤被氧化为尿酸。尿酸是人体内一些有害活性物质的有效清除剂，包括羟自由基、超氧负离子、单态氧及高铁血红素等[1]，因此嘌呤代谢正常的人食用含嘌呤较高的食物对机体是有益的。但是经常进食高嘌呤类食物，使肾脏不能将过多的嘌呤代谢物经尿液排出，会造成血液尿酸的浓度超过正常值，尿酸盐晶体可沉积于关节、软组织、骨骼和肾脏等处，从而引发一系列疾病，如痛风病、高尿酸血症、肾脏疾病等等[2-3]。

目前关于酒类食物中嘌呤的研究主要集中在啤酒上[4]，其他酒类中嘌呤的研究则罕见报道。黄酒属于非蒸馏酒，也含有一定量的嘌呤。对黄酒中嘌呤的检测研究可为补充完善我国食物成分数据库提供数据，为痛风等嘌呤代谢障碍性疾病患者的健康饮酒提供参考。

反相色谱是目前嘌呤最常用的分离模式[5-6]。微粒填料技术、化学键合技术以及合适的流动相使反相色谱系统能有效、快速分离许多化合物。本实验通过反相高效液相色谱法同时测定黄酒中游离的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤及黄嘌呤，建立了一种方便、快捷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品：市售某品牌黄酒。

试剂：腺嘌呤（BR）、鸟嘌呤（BR）、黄嘌呤（BR）、次黄嘌呤（BR）、85%磷酸（AR）、KH2PO4（AR）、NaOH（AR），所有试剂均由国药集团化学试剂有限公司生产。

仪器：高效液相色谱仪（Agilent1260），精密电子天平（梅特勒-托利多，ME204E），酸度计（梅特勒-托利多，S220）。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm× 250 mm，5μm）；柱温：25℃；流动相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH4.0）；流速：1m L/m in；进样量：20μL；检测器：紫外检测器（UV）；检测波长：254 nm。

1.3 标准曲线

准确称取腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤标样25mg，分别用超纯水定容至25m L，配制浓度为1mg/m L的标准储备溶液（嘌呤不易溶于水，可加入NaOH溶液助溶）。将标准储备溶液稀释配制成标准系列浓度：0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L。在上述色谱条件下进行分析，以每种物质的峰面积与标样浓度做线性回归曲线。

1.4 样品测定

将待测黄酒样品用0.45μm针式过滤头过滤，滤液进行HPLC分析。

2 结果分析

2.1 色谱分析条件的确认

嘌呤为弱极性碱性化合物，可采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱分析。柱温、流动相组分、流动相pH值和流速等对4种嘌呤的分离效果均有一定的影响，参考他人的研究成果[7-8]发现，以0.02mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH4.0）为流动相，在1m L/m in流速下，25℃柱温时，4种嘌呤在15m in内可达到完全分离（见图1），出峰顺序依次为鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤，与文献结果一致。

图1 4种嘌呤标准品色谱图

鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤均有共轭双键，在紫外区有强烈的吸收，其吸收峰在220～300 nm之间。用二极管阵列检测器（DAD）对嘌呤标样进行检测，并保存全光谱，结果见图2。综合考虑各种嘌呤的吸收峰，选择以254 nm作为检测波长。

图2 4种嘌呤标准品的全光谱图

2.2 标准曲线方程和相关系数

在上述方法条件下，分别将配制的各组分浓度为0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L的混合标准溶液注入液相色谱仪进行分离测定，以峰面积与标样浓度绘制标准工作曲线，结果见表1。由表1可知，在0.5～20mg/L浓度范围内，4种嘌呤的峰面积响应值与浓度呈良好的线性关系，相关系数R2大于0.9990。

2.3 精密度和检出限

同一样品连续进样6次，在相同的条件下进行色谱分析，根据测定结果计算相对标准偏差RSD，结果显示RSD值均小于2%（见表2）。说明本方法重复性良好，符合分析检测试验的要求。以信噪比3∶1为检出限，信噪比10∶1为定量限计算其检测限，结果见表2。

表1 各嘌呤的标准曲线

表2 嘌呤的精密度及检测限

2.4 加标回收率

向已知嘌呤含量的黄酒样品中加入一定量的嘌呤标准品，进行加标回收率实验，结果见表3。

2.5 黄酒中4种游离嘌呤的测定结果

对市售某品牌黄酒中的游离嘌呤进行测定，采用保留时间与光谱图定性，外标法定量。测得游离鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤分别为1.29mg/L、2.93mg/L、3.92mg/L和4.30mg/L。

3 结论

反相高效液相色谱法同时测定黄酒中4种游离嘌呤的条件为：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，柱温25℃，进样量20μL，0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH4.0）为流动相，流速1.0 m L/m in，检测波长254 nm。4种嘌呤的标准曲线呈良好的线性关系，相关系数R2大于0.9990，检出限在0.02～0.17mg/L。鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤以该方法测定时的精密度分别为0.8%、0.6%、1.4%和1.5%，加标回收率分别为89.9%，105%、92.1%和94.1%，符合分析检测试验的要求。通过该方法测得市售某品牌黄酒中游离鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤分别为1.29mg/L、2.93mg/L、3.92mg/L和4.30mg/L。

[1]张昌颖.核酸生物化学[M].北京：人民卫生出版社,1993：307-330.

[2]FUKUUCHIT,YAMAOKAN,KANEKO K.Analysisof intra-and extracellular levelsof purinebases, nucleosides,and nucleotides in HepG2Cellsby highperformance liquid chromatography[J].Analytical sciences,2015,31(9)：895-901.

[3]陈伟,方卫纲,顾苹,等.富嘌呤食物摄入及肥胖、饮酒等因素与高尿酸血症的相关性[J].中国临床营养杂志,2007, 15(2)：70-74.

[4]王海容,付大友.啤酒中嘌呤类物质测定方法的研究进展[J].酿酒科技,2009(6)：95-98.

[5]FUKUUCHIT,YASUDAM,INAZAWAK,etal.A simple HPLCmethod for determining the purine content of beerand beer-like alcoholic beverages[J].Analytical sciences,2013,29(5)：511-517.

[6]吕兵兵,张进杰,储银,等.反相高效液相色谱法检测带鱼糜中的嘌呤含量[J].中国食品学报,2012,12(7)：192-198.

[7]王海容,王蓉,付大友,等.啤酒中嘌呤类物质的测定研究[J].酿酒科技,2008(10)：107-110.

[8]凌云,王新宴,雍炜,等.高效液相色谱法检测肉类食品中4种嘌呤碱[J].分析化学,2008,36(6)：724-728.

SimultaneousDeterm ination of Four Free Purines in Yellow RiceW ine by Reversed Phase HPLC

LIU Zhen,WANG Lingzhi,ZHANG Shanshan,GELeyong,ZHUGEQing and ZENGHongyan
(NationalQuality Supervision&Testing Center for Yellow RiceWine,Shaoxing Instituteof Food and Drug Testing,Shaoxing,Zhejiang 312000,China)

A simplemethod for simultaneous determination of four free purines in yellow ricew ine by RP-HPLC had been developed. Within the range of 0.5mg/L to 20mg/L,the response of each purine showed a good linear relationship w ith its correlation coefficient R above 0.9990,RSD w ithin 0.8%to 1.5%,detection lim its between 0.02mg/L to 0.17mg/L,and the recoveries between 89%to 105%.The determ ination results suggested that the contentof free adenine,guanine,hypoxanthine and xanthine in yellow rice w ine were4.30mg/L,1.29mg/L,2.93mg/L and 3.92mg/L respectively.

purine;yellow ricew ine;high performance liquid chromatography

TS262.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）04-0100-03

10.13746/j.njkj.2016347

2016-11-23

刘镇(1986-)，女，工程师，博士，主要从事食品检测。

优先数字出版时间：2017-01-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170125.0851.008.htm l。