miR-425对胶质瘤细胞迁移与侵袭的影响

焦克平 赵玉梅 张晓敏

(甘肃省人民医院干部病房神经内科，甘肃 兰州 730000)

miR-425对胶质瘤细胞迁移与侵袭的影响

焦克平 赵玉梅 张晓敏1

(甘肃省人民医院干部病房神经内科，甘肃 兰州 730000)

目的 探讨miR-425对人胶质细胞瘤U87细胞迁移与侵袭能力的影响。方法 利用Lipo2000转染试剂体外瞬时转染人胶质细胞瘤U87，将细胞分为实验组(转染miR-425 mimics)、抑制组(转染miR-425 inhibitors)、空白组(无转染)。Real-time PCR检测细胞中miR-425表达；划痕实验检测细胞的迁移距离，Transwell实验检测细胞的迁移以及侵袭能力，Western印迹检测基质金属蛋白(MMP)2、MMP9的表达水平。结果 与空白组相比，miR-425 mimics组miR-425表达明显上调，约为空白组的8倍，细胞侵袭与迁移能力下降，MMP2、MMP9表达下降，miR-425 inhibitors组miR-425表达明显下调，约为空白组的0.14倍，细胞侵袭与迁移能力显著增强，MMP2、MMP9表达增强。结论 miR-425的表达水平与胶质瘤U87细胞的迁移与侵袭能力密切相关。

胶质瘤；miR-425；侵袭；迁移

胶质瘤具有发病率高、易复发等特点〔1〕。标准治疗方案是手术切除联合放疗、化疗，但胶质瘤的侵袭性生长已成为胶质瘤治疗的一大障碍〔2〕。

Micro RNAs(miRNAs)广泛存在于真核生物中，是一类具有调节功能，但不能被编码的单链RNA，不仅是癌症形成的促进子，还是其抑制子；还能通过多种分子机制调控肿瘤的侵袭与转移能力，在调节肿瘤的形成和发展中发挥作用〔3〕。前期研究发现，miR-425的表达可能与胶质瘤的生物学功能有关，然而目前关于miR-425在胶质瘤方面的作用研究还很少。本研究拟探讨在胶质瘤细胞株中转染miR-425模拟物以及抑制物对细胞侵袭迁移的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 U87胶质瘤细胞购于中科院上海细胞研究所。miR-425模拟物和miR-425抑制物购自西安沃尔森生物技术有限公司。DMEM高糖细胞培养液，DMEM-FBS培养液购自美国Gibco公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，Taqman MicroRNA Real-time PCR试剂盒购自美国Gene Copoeia公司，胰蛋白酶购自德国Miltenyi Biotec公司，紫外分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司、实时定量PCR仪购自西安天隆科技有限公司。

1.2 胶质瘤细胞U87的培养 U87细胞用含10%胎牛血清的DMEM在5% CO2，37℃培养箱内培养3～4 d。细胞粘连后，用0.25%胰蛋白酶消化。然后根据实验需要，按照铺满的要求3倍稀释细胞，把细胞接种于不同的培养板中。

1.3 细胞转染 将对数生长期的U87细胞接种于6孔板中。将Lipo 2000转染试剂分别与20 μmol/L的miR-425 mimics和miR-425 inhibitors等体积混合后，室温孵育15 min，加入6孔板，使用无血清培养基继续培养6 h，之后换用10% FBS的DMEM继续培养2 d。

1.4 Real-time PCR检测miR-425的表达 使用miRNA抽提试剂盒的使用方法提取U87细胞的总RNA，并检测RNA浓度。按照反转录试剂盒说明进行反转录合成cDNA，将cDNA加入到Taqman MicroRNA Real-time PCR试剂盒，在实时PCR仪上进行定量检测。并采用2-△△Ct方法分析miR-425在不同细胞中的相对表达水平。

1.5 Transwell实验检测细胞迁移能力 将转染过24 h的细胞制成单细胞悬液，取200 μl悬液加入Transwell小室的上室，向小室的下室加入600 μl含胎牛血清的DMEM培养基，将小室置于37℃、5% CO2培养箱继续培养，2 h后取出，进行固定、染色，放置在倒置显微镜下拍照并计数。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力 当转染24 h后取出6孔板，使用事先消毒处理过的加样枪头垂直在培养板中部及两侧划3条平行直线。加入新鲜培养基后置于37℃、5% CO2培养箱继续培养。划痕后分别在24 h后进行观察，并统计细胞的迁移距离。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力 Transwell小室上室侧铺一层基质胶后，接种不含FBS的经过转染24 h的细胞悬液，下室加入含FBS的完全培养基，将Transwell小室置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养12 h，并进行固定、染色，随后放置于倒置显微镜下拍照并计数。每组细胞使用3个Transwell小室，在倒置显微镜下每个小室随机选取5个视野进行计穿过基底膜的细胞数，并进行统计。

1.8 Western印迹检测基质金属蛋白酶(MMP)2、9活性 使用蛋白提取试剂盒提取转染后细胞的总蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后，100℃煮沸制备蛋白样品。配置8%的蛋白胶，蛋白胶凝固后进行上样，上样时应保证每孔蛋白量一致，恒压80 V电泳，待Marker跑出浓缩胶时，换用120 V电压继续电泳，直至溴酚蓝跑出玻璃板。冰浴100 V进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭6 h，以MMP2、9抗体作为一抗，4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，5 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗之后常温孵育1 h，TBST清洗纤维素膜3次，5 min/次。采用增强化学发光法(ECL)发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。

1.9 统计学方法 使用GraphPad Prism 5软件行t检验。

2 结 果

2.1 Real-time PCR检测miR-425的相对表达 转染miR-425 mimics的U87胶质瘤细胞中miR-425的表达水平(8.00±0.189)较空白组(1.00)显著上升(P<0.01)，miR-425 inhibitors中miR-425的表达水平(0.14±0.162)显著下降(P<0.01)。说明在U87细胞中成功转染miR-425的mimics及inhibitors。

2.2 miR-425表达水平对U87细胞侵袭的影响 相对于对照组迁移细胞〔(150.90±5.83)个〕，miR-425 mimics组细胞侵袭能力显著下降〔(76.87±5.42)个〕，miR-425 inhibitors组显著上升〔(255.58±7.42)个〕(P<0.05)。说明高表达miR-425可以有效抑制U87细胞的侵袭。

2.3 miR-425表达水平对U87细胞迁移的影响 转染miR-425 mimics后，与对照组〔(660.12±5.62)个，(0.67±0.02)cm〕相比，miR-425 mimics组细胞迁移率及迁移距离〔(30.60±4.32)个，(0.52±0.03)cm〕显著下降，miR-425 inhibitors组〔(89.68±5.92)个，(0.95±0.02)cm〕显著上升(P<0.05)。

2.4 miR-425表达水平对MMP2和MMP9蛋白表达的影响 转染miR-425 mimics后，与对照组相比，miR-425 mimics组MMP2和MMP9蛋白表达下降，miR-425 inhibitors组表达上升。见图1。

图1 miR-425表达对MMP2和MMP9蛋白表达的影响

3 讨 论

胶质瘤的难治愈性主要取决于它的侵袭与迁移〔4〕，胶质瘤细胞对周围脑组织的侵袭性严重限制着治疗的有效性，目前对胶质瘤的治疗手段受到诸多限制〔5〕。

miRNAs是一类内源性非编码的小分子RNA，长度约为18～25个核苷酸，能与特定的mRNA分子的3′UTR结合，阻碍mRNA的翻译，甚至会导致mRNA降解。研究表明，miRNAs参与多种病理过程，还参与胚胎形成与发育过程〔6，7〕。近年来研究发现miRNAs的异常表达与特定肿瘤之间也存在相关性，部分miRNAs对肿瘤的形成发育有抑制作用〔8〕。本研究侵袭与迁移实验显示，U87中miR-425的表达量提高后穿过Transwell滤膜的细胞数明显减少，且肿瘤细胞的迁移距离明显变短，表明细胞侵袭与迁移能力均下降；相反下调miR-425表达后，穿膜细胞数目显著增加，肿瘤细胞的迁移距离增加，表明细胞的侵袭与迁移能力增长。MMPs是一类锌离子依赖蛋白酶〔9〕，在肿瘤的侵袭与迁移过程中起重要作用。研究发现MMP2和MMP9与胶质瘤的侵袭能力高度相关〔10，11〕。本研究表明miR-425的表达水平能调节胶质瘤细胞U87的侵袭、迁移能力，这种调节与肿瘤细胞中MMP2和MMP9蛋白的表达密切相关。

1 Dwyer CA，Bi WL，Viapiano MS，etal.Brevican knockdown reduces late-stage glioma tumor aggressiveness〔J〕.J Neurooncol，2014；120(1)：63-72.

2 廖 珩，魏 君，宋 鑫，等.老年脑胶质瘤患者术后心理状况及其影响因素〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(23)：5971-2.

3 Berger F，Reiser MF.Micro-RNAs as potential new molecular biomarkers in oncology：have they reached relevance for the clinical imaging sciences〔J〕?Theranostics，2013；3(3)：943-52.

4 Song Y,Luo Q,Long H，etal.Alpha-enolase as a potential cancer prognostic marker promotes cell growth，migration，and invasion in glioma〔J〕.Mol Cancer，2015；13(1)：65.

5 Le Rhun EL，Taillibert S，Chamberlain MC.Anaplastic glioma：current treatment and management〔J〕.Expert Rev Neurother，2015；15(6)：601-20.

6 Adnot S，Amsellem V，Boyer L，etal.Telomere dysfunction and cell senescence in chronic lung diseases：therapeutic potential〔J〕.Pharmacol Therap，2015；153(10)：125-34.

7 Gonzlez-Gonzalez M,Rito-Palomares M.Application of affinity aqueous two-phase systems for the fractionation of CD133+ stem cells from human umbilical cord blood〔J〕.J Mol Recogn，2015；28(3)：142-7.

8 Bartonicek N，Maag JL，Dinger ME.Long noncoding RNAs in cancer：mechanisms of action and technological advancements〔J〕.Mol Cancer，2016；15(1)：43.

9 Bodin S，Mattioli E，Fröhlich S，etal.Regulation der expression von MMPs und TIMPs nach transplantation von mesenchymalen stammzellen in rattenmodell der chronisch-toxischen Leberschädigung〔J〕.Zeitschrift Für Gastroenterologie，2015；53(1)：377-90.

10 吴建珩，李晓辉，吴世陶，等.ARK5和MMP-2在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义〔J〕.中风与神经疾病杂志，2013；30(7)：594-7.

11 Christoffersson G，Vagesjo E，Giraud A，etal.A distinct subset of proangiogenic CD11b(+)/Gr-1(+)/CXCR4(+)/MMP-9(hi) neutrophils are recruited by VEGF-A to transplanted hypoxic tissue〔J〕.Eur J Clin Investig，2013；43(23)：9-9.

〔2016-12-13修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

1 云南省第二人民医院神经内科

张晓敏(1977-)，女，主治医师，主要从事脑血管疾病研究。

焦克平(1977-)，女，主治医师，硕士，主要从事神经免疫性疾病研究。

R739.4

A

1005-9202(2017)07-1615-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.020