3种口蹄疫O型抗体检测试剂盒对疫苗免疫牛血清抗体检测的比较试验

董春娜， 马爱荣,2， 张 蕾， 李 静， 巴利民， 王振豹， 齐 鹏， 汪 明， 肖 进

(1. 中牧实业股份有限公司 农业部兽用生物制品与化药重点实验室 北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心，北京 海淀 100095 ； 2. 中牧股份兰州生物药厂，甘肃 兰州 730046 ； 3.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物的烈性传染病，该病传播途径多、传染性强，严重危害畜牧业发展及畜产品生产供应，世界动物卫生组织(OIE)在1984年将其列为A类传染病之首[1]。我国每年都投入大量人力、物力和财力用于口蹄疫的防控，疫苗的免疫效果直接影响着口蹄疫防控的成败，因此加强针对口蹄疫疫苗免疫后动物的免疫抗体水平的监控，才能确保疫苗的免疫效果，从而做好口蹄疫的防控[2]。酶联免疫吸附试验(ELISA)在口蹄疫抗体检测中因其具有敏感、特异、稳定、快速等特点而备受青睐，为了进一步了解不同检测方法的相关性和特点，同时为了对本实验室研制的基于合成肽包被抗原的间接ELISA试剂盒进行评价，本试验选取了国际上广泛使用的基于单克隆抗体的进口阻断ELISA试剂盒(Prionics-O)，当前国内广泛使用的基于多克隆抗体的液相阻断ELISA试剂盒(LB-O)和本实验室研制的基于合成肽包被抗原的间接ELISA试剂盒(iELISA-O)3种试剂盒进行比对试验，对3种试剂盒的符合程度、重复性和便捷性进行比较，以期选择更简单、更准确的方法用于大规模检测，从而做好口蹄疫防控工作。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 口蹄疫病毒O型抗体检测阻断ELISA试剂盒(Prionics-O) 由瑞士Prionics公司生产，批号为：O160501L。

1.1.2 口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(LB-O) 由中国农业科学院兰州兽医研究所研制生产，批号为：20170221101-1。

1.1.3 自制间接ELISA试剂盒(iELISA-O) 基于合成肽包被抗原的间接ELISA试剂盒，批号为2016001。

1.1.4 被检血清 从临床送检血清中选择免疫口蹄疫O型灭活疫苗后第14天、21天和第28天血清各50份，共150份血清。

1.2 方法

1.2.1 检测结果一致性的比较 对150份血清样品分别使用Prionics-O、LB-O和iELISA-O 3种试剂盒同时进行检测，分别按其说明书进行操作(LB-O操作中，根据其说明书，血清进行1∶128倍稀释来判定阴阳性)，最后以3种试剂盒各自判定标准进行结果判定，对各试剂盒检测的抗体水平进行统计，分别用Kappa统计方法比较其一致性。Kappa值计算方法按照文献[3]的方法进行，Kappa值越高代表一致性越好。Kappa值<0.40，表明两种方法间一致性较差；Kappa值在0.41～0.60，中度符合；Kappa值在0.61～0.80，高度符合；Kappa值在0.81～1.00，完全符合。

1.2.2 重复性比较 从150份血清样品中随机抽取15份血清，应用同一批试剂盒，分2次检测，比较2次检测结果，对各试剂盒的重复性进行评价。

1.2.3 结果判定

1.2.3.1 Prionics-O结果判定PI值<50%，判为阴；PI值≥50%，判为阳性。PI值=100-(待检样品OD450nm值/阴性对照OD450nm值×100)。

1.2.3.2 LB-O结果判定 以病毒抗原对照OD450nm值的50%为临界值，被检血清稀释孔OD450nm值大于临界值为阴性，小于或等于临界值为阳性，抗体滴度≥1∶128判定阳性。

1.2.3.3 iELISA-O结果判定 临界值(Cut-off值)=阳性对照孔OD450nm均值×0.17；待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。

2 结果与分析

2.1 3种试剂盒检测结果一致性的比较 用Kappa值对3种试剂盒的检测结果，两两试剂盒之间进行一致性检验，结果显示Prionics-O与LB-O的Kappa值为0.86，表明Prionics-O与LB-O完全符合(表1)；Prionics-O与iELISA-O的Kappa值为0.89，表明Prionics-O与iELISA-O完全符合(表2)；LB-O与iELISA-O的Kappa值为0.84，表明LB-O与iELISA-O完全符合(表3)。

表1 Prionics-O试剂盒与LB-O试剂盒一致性分析

注：Kappa值=0.86

表2Prionics-O试剂盒与iELISA-O试剂盒一致性分析

iELISA-OPrionics-O+-合计+1330133-31417合计13614150

注：Kappa值=0.89

表3 LB-O试剂盒与iELISA-O试剂盒一致性分析

注：Kappa值=0.84

2.2 3种试剂盒在不同时间对免疫血清的检出率 检测结果显示(表4)，3种试剂盒检测血清中的抗体阳性率随着时间的延长而呈现不断升高的趋势，虽然3种试剂盒均可在免疫后第28天100%检测到牛血清中的口蹄疫O型抗体，但疫苗免疫后第14天，Prionics-O和iELISA-O均可检测到36/50牛血清中口蹄疫O型抗体阳性，LB-O可检测到35/50牛血清中口蹄疫O型抗体阳性；免疫后第21天，Prionics-O试剂盒100%检测到牛血清中的口蹄疫O型抗体，LB-O和iELISA-O分别可检测到47/50和49/50牛血清中口蹄疫O型抗体阳性。因此，Prionics-O试剂盒检测敏感性稍高于国产的两种试剂盒。

表4 3种试剂盒在不同时间对免疫牛血清阳性检出统计

注：分子为检测阳性血清份数，分母为检测血清份数

2.3 3种试剂盒重复性比较 检测结果如表5所示，3种试剂盒前后两次检测结果虽然PI值/OD值略有不同，但是结果判定完全一致，因此，国内广泛使用的口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒和本实验室研制的基于合成肽包被抗原的间接ELISA试剂盒与国际上广泛使用的瑞士Prionics公司生产的口蹄疫病毒O型抗体检测阻断ELISA试剂盒一样，具有良好的重复性。

表5 重复性比较试验

注：N表示结果判定为阴性，P表示结果判定为阳性。Test1和test2分别表示第1次检测和第2次检测

2.4 3种试剂盒便捷性比较 应用Prionics-O试剂盒检测一批样品耗时大约3～4 h、应用iELISA-O试剂盒检测一批样品耗时大约1.5～2 h，且这两种试剂盒操作也较为简单，而应用LB-O试剂盒进行检测需要1天1夜才能出结果，从操作便捷性来说，iELISA-O试剂盒最优，Prionics-O试剂盒其次，LB-O试剂盒不仅操作麻烦，而且耗时较长。

3 讨论

通过进口阻断ELISA试剂盒，国产液相阻断ELISA试剂盒和间接ELISA试剂盒3种试剂盒对150份免疫血清的检测结果可知，3种试剂盒检测结果之间具有较高的符合性，本实验室研制的试剂盒与进口试剂盒的符合程度稍高。总体而言，进口试剂盒的敏感性高于其他两种试剂盒，这可能是由于进口试剂盒是基于单克隆抗体研制的试剂盒，单克隆抗体针对的表位是口蹄疫O型上较为保守位点，因此受病毒毒株变异的影响较小，因此阳性检出率会更高，而液相阻断ELISA由于其用于中和血清抗体的是全病毒抗原，受口蹄疫毒株变异的影响较大，如果动物免疫的毒株与试剂盒病毒抗原不匹配就会影响其检测的敏感性。本实验室研制的试剂盒，为了克服口蹄疫毒株变异对检测结果的影响，在抗原设计方面尽可能涵盖了目前国内主要流行的毒株和疫苗中使用的毒株，因此检测的敏感性有一定的提升，但敏感性还是稍低于进口试剂盒。

重复性结果显示，3种试剂盒检测结果的重复性都较好，因此可以说这3种试剂盒的检测结果均是可靠的，可应用于口蹄疫疫苗免疫后的抗体水平的检测。从价格上来说，进口试剂盒价格相较于国产试剂盒为昂贵，仅适合于实验室研究和一些实力较为雄厚的养殖场使用，国产试剂盒在价格上优势较为明显。从操作便捷性来说，本实验室研制试剂盒显著优于其他两种商品化试剂盒，不仅操作简单，而且耗时较短。

[1] 普拉. 口蹄疫流行病学及其防制[J]. 山东畜牧兽医, 2011, 32(9): 44-45.

[2] 何继军, 郭建宏, 刘湘涛. 我国近年口蹄疫流行形势与主要流行毒株概况[J]. 中国动物检疫, 2015，32(6):10-14.

[3] 夏邦世, 吴金华. Kappa一致性检验在检验医学研究中的应用[J]. 中华检验医学杂志, 2006,29(1):83-84.