维生素K代谢相关基因CYP4F2参与凝血因子FⅨ活化的研究

刘 佳，秦留安，席少枝，刘 军，王绪云，李晓琪，杨 洁，尹 彤

(解放军总医院心内科，北京 100853)

维生素K循环是机体内维生素K依赖性凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)活化的重要通路，环氧型维生素K经维生素K环氧化物还原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR，编码基因VKORC1)转变为维生素K，然后在VKOR的作用下，转化为还原型维生素K，参与维生素K依赖性凝血因子的羧化反应[1]。由于维生素K循环是通过少量维生素K的反复利用，实现维生素K的氧化还原和γ羧化，因此，肝脏维生素K循环中的维生素K含量的稳态对凝血因子活化反应的影响更直接和显著。近年研究表明，在维生素K循环中，细胞色素P450家族的成员CYP4F2具有氧化水解维生素K的功能[1]，因此，CYP4F2有可能通过改变维生素K循环中维生素K含量的稳态影响凝血因子的活化，从而发挥其对凝血功能的影响。我们前期针对维生素K拮抗剂华法林的药物基因组学研究发现，在维生素K代谢和循环通路上的候选基因(VKORC1、GGCX、CYP4F2、EPHX1、APOE、NQO1、CALU)中，只有CYP4F2基因变异型与华法林出血并发症相关。经校正维生素K摄取等临床环境因素和已知相关基因变异因素(CYP2C9*3)后[2，3]，其中携带CYP4F2rs3093168 CC基因型患者发生严重出血并发症的风险是非携带者的7.61倍[4]，提示CYP4F2基因是影响华法林出血并发症的重要相关基因，其作用机制可能与CYP4F2参与影响凝血因子的活化密切相关。尽管如此，目前尚未见CYP4F2对维生素K依赖性凝血因子活性影响的相关文献报道。鉴于此，本研究以维生素依赖性凝血因子FⅨ活性的改变为例，通过在人肝细胞系LO2细胞中过表达CYP4F2和凝血因子FⅨ，探讨CYP4F2对维生素K依赖性凝血因子活化的影响，以期为基于药物基因组学的维生素K拮抗剂个体化抗凝治疗提供新的生物功能依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

携带人CYP4F2-cDNA的pCR4Zero质粒[5]和携带人凝血因子FⅨ-cDNA的pIRES质粒[6]分别由美国密西西比大学医学中心Stec教授和德国乌尔茨堡大学人遗传学研究所Czogalla教授惠赠。人正常肝脏细胞系LO2细胞购自军事医学科学院细胞库。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、1640细胞培养基、胎牛血清及Lipofectamine 2000 转染试剂为 Invitrogen 公司产品。XbaⅠ与SalⅠ核酸限制性内切酶购自TAKARA公司。FⅨ抗体、CYP4F2抗体及FⅨa活性检测试剂盒购自ABCAM公司。

1.2 质粒构建

通过携带人CYP4F2-cDNA的pCR4Zero质粒和携带人凝血因子FⅨ-cDNA的pIRES质粒，构建同时含有CYP4F2-cDNA片段与FⅨ-cDNA片段的pIRES质粒。步骤如下：根据NCBI的CYP4F2基因CDS序列设计扩增引物。上游引物 5’-tctagaatgtcccagctgagcctgtc-3’，下游引物5’-gtcgactcagctcaggggctccaccc-3’。以pCR4Zero-CYP4F2质粒作为模板，PCR 扩增CYP4F2基因 CDS 片段。反应体系：DNA模板1.5 μl、taq Master Mix 12.5 μl、上下游引物各0.8 μl、ddH2O 9.4 μl。用2.0% 琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR产物，扩增后的CYP4F2-cDNA片段连接到T载体。取连接产物转化TOP10感受态细胞，将转化菌液涂布于含氨苄青霉素(100 mg/ml) 的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取生长状态良好的菌落培养，提取质粒后使用XbaⅠ与SalⅠ核酸限制性内切酶分别双酶切pIRES-FⅨ-cDNA质粒和连接CYP4F2-cDNA片段的T载体。使用T4连接酶16℃条件下将CYP4F2-cDNA片段连接到pIRES质粒的MCS B区域 (此前pIRES质粒的MCS A区域已经包含FⅨ-cDNA片段)，构建pIRES-FⅨ-cDNA质粒。取连接产物转化TOP10感受态细胞，将转化菌液涂布于含氨苄青霉素(100 mg/ml) 的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取生长状态良好的菌落培养，提取质粒进行双酶切并测序鉴定。

1.3 细胞培养及转染

使用含10%胎牛血清及5%双抗的1640培养基培养LO2细胞，常规换液、传代。取生长状态好的LO2细胞使用胰蛋白酶消化计数，将6×105细胞种植于直径为6 cm的平皿中。用含10%胎牛血清及3 nmol/L维生素K1(维生素K1使用10倍DMSO稀释后加入培养基)的1640培养基在37℃，5%CO2的孵箱内培养过夜。待细胞融合面积达70%～80%后，更换无血清无双抗的1640培养基。将8 μg pIRES-FⅨ质粒溶于500 μl Opti-mem无血清培养基中(A管)。另将20 μl Lipofectamine 2000 转染试剂溶于500 μl Opti-mem无血清培养基中(B管)，室温静置 5 min 后将两管混合摇匀，室温孵育20 min后将混合液缓慢加入LO2细胞中，混匀后置于37℃，5%CO2培养箱中培养。同样方法转染pIRES-FⅨ-CYP4F2 质粒以及pIRES空白对照质粒。每组质粒做复孔同步转染。5 h后更换新的含10%胎牛血清及3 nmol/L维生素K1的1640培养基。48 h后收集培养上清于-80℃保存。

1.4 蛋白免疫印迹

质粒转染48 h后，分别刮取各组细胞，加入RIPA高效细胞裂解液。小心吸取上清提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒 (Solarbio, 中国) 进行蛋白定量。分别将各组蛋白加入1/4体积的蛋白上样缓冲液后置于沸水中煮5 min加样，每组蛋白上样30 μg。SDS-PAGE 凝胶电泳 100 V、 1.5 h、半干转法将凝胶蛋白转至PVDF膜。转膜条件：恒流300 mA，2 h。使用5% 脱脂奶粉37℃封闭1 h。将目的蛋白条带和内参条带剪开，两张含有目的蛋白的膜分别加入1∶1000稀释的FⅨ 抗体以及1∶1000稀释的CYP4F2 抗体，含有内参蛋白的膜加入1∶1000稀释的GAPDH内参抗体(Solarbio,中国)，置于4℃冰箱过夜。TBST 洗膜10 min，共3次。然后分别加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体 (Solarbio,中国)，37℃孵育1 h。再次 TBST 洗膜10 min，共3次。用ECL化学发光检测试剂 (Solarbio, 中国) 放射自显影检测FⅨ和CYP4F2蛋白表达。

1.5 凝血因子活性检测

根据FⅨa Assay检测试剂盒说明书，将每组蛋白裂解液各取10 μg 分别加入96孔板中，然后分别加入10 μl 配制好的master mix溶液，加入FⅨa Assay Buffer 溶液至98 μl，混匀后37℃孵育15 min。每个孔中加入2 μl FⅨa substrate-AMC 溶液，混匀。避光37℃孵育30 min后放入荧光酶标仪(Ex/Em=360/450 nm)。将每组细胞培养上清各取10 μl加入96孔板中，同样的方法对细胞培养上清中FⅨa活性进行检测。以上检测各组样本均做复孔重复3次，结果取均值。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 PCR 扩增目的基因和构建质粒

PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳30 min后可得到一条大小约1700 bp的扩增条带(图1A)，与 NCBI 中CYP4F2基因 CDS 大小一致，提示成功克隆CYP4F2基因。pIRES-FⅨ-CYP4F2质粒经XbaⅠ与SalⅠ核酸限制性内切酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳50 min后可获得1条大约1700 bp条带(图1B)，与NCBI中CYP4F2基因CDS大小一致，测序后证实含有CYP4F2-cDNA片段，提示质粒构建成功。

2.2 转染后蛋白表达

转染pIRES-FⅨ质粒以及pIRES-FⅨ-CYP4F2质粒后，FⅨ和CYP4F2的表达显著增加 (P<0.05；图2)，提示质粒转染成功并正常表达。

2.3 凝血因子活性检测

使用FⅨa活性检测试剂盒以及荧光酶标仪对各组细胞裂解液及培养上清FⅨa进行定量分析。发现过表达FⅨ后LO2细胞FⅨa的活性较正常对照组明显升高[培养上清：(2268.67±114.15)vs(1614.00±69.67)，P=0.038；细胞裂解液：(1097.33±55.52)vs(778.67±36.01)，P=0.041]。提示细胞中FⅨa的活性与FⅨ表达呈正相关。而同时过表达CYP4F2和FⅨ后LO2细胞FⅨa的活性较过表达FⅨ组明显降低[培养上清：(1540.00±72.64)vs(2268.67±114.15)，P=0.032；细胞裂解液：(1805.33±10.50)vs(1097.33±55.52)，P=0.036]。提示维生素K代谢相关基因CYP4F2过表达对凝血因子的活化具有抑制作用，进一步对凝血产生影响。具体结果见图3。

图1 CYP4F2基因PCR扩增产物和pIRES-FⅨ-CYP4F2重组质粒酶切

Figure 1 Electrophoresis of CYP4F2 PCR product and enzyme cleave identification of recombinant plasmid

M1: D2000 DNA marker; 1: PCR product; M2: 1kb plus DNA marker; 2: pIRES-FⅨ-CYP4F2 plasmid cleaved byXbaⅠ/SalⅠ; 3: pIRES-FⅨ-CYP4F2 plasmid

图2 各组LO2细胞FⅨ及CYP4F2蛋白表达Figure 2 FⅨ and CYP4F2 protein expression of different LO2 cells Control: empty plasmid (pIRES); FⅨ: recombinant plasmid (pIRES- FⅨ); CYP4F2+FⅨ: recombinant plasmid (pIRES-FⅨ-CYP4F2). Compared with control group, *P<0.05

图3 各组LO2细胞裂解液和培养上清液中FⅨa定量分析Figure 3 Quantitative analysis of FⅨa in cell culture supernatant and lysis solution from different plasmids

A: cell supernatant; B: cell lysates. Control: empty plasmid (pIRES); FⅨ: recombinant plasmid (pIRES-FⅨ); CYP4F2+FⅨ: recombinant plasmid (pIRES-FⅨ-CYP4F2); RFU: relative fluorescence units. Compared with control group,*P<0.05

3 讨 论

CYP4F2基因是CYP450超家族的成员之一，位于19号染色体短臂，全长约20 kb，由13个外显子和12个内含子组成[7]。CYP4F2编码的蛋白具有氧化水解维生素K的功能，通过羟基化维生素K苯基侧链导致维生素K循环中还原型维生素K水平下降[1]。CYP4F2基因突变后对维生素K的代谢能力改变，造成维生素K蓄积或减少。多个研究表明CYP4F2*3基因型与华法林高剂量有关[8，9]。但CYP4F2与出血并发症的相关性及作用机制研究相对较少。本研究通过在人肝细胞中过表达CYP4F2和FⅨ后发现，CYP4F2对维生素K依赖性凝血因子的活化具有抑制作用。该研究表明，CYP4F2的过表达可能增强了对维生素K循环中维生素K的氧化水解，导致还原型维生素K含量降低，进而导致凝血因子γ羧化反应减弱，凝血因子活性降低。由于经肝脏维生素K循环进行的凝血因子γ羧化反应的变化与维生素K拮抗剂华法林出血并发症的发生直接相关，因此，本研究为前期发现的CYP4F2基因变异型与华法林出血并发症的关联性提供了生物功能依据[4，10]。

本研究通过补充外源性维生素K1使细胞培养液中维生素K1浓度达到3 nmol/L，该浓度与人血浆中维生素K浓度接近[11，12]，因此，既能保证细胞完成正常的维生素K循环，又能避免外源性维生素对实验造成的干扰。由于FⅨ是分泌蛋白，因此本研究分别采用细胞裂解液和细胞培养上清液作为样本检测FⅨa的活性。结果显示，无论是在细胞裂解液还是细胞培养上清液中，过表达CYP4F2后，FⅨa的活性均降低。另外，在肝细胞的维生素K循环中VKOR为关键酶[5]，在维生素K的氧化还原过程中发挥重要作用。本研究在细胞培养过程中未额外转染外源性VKOR，而是依靠细胞内源性VKOR完成维生素K循环及凝血因子羧化反应。这样可能存在因细胞内源性VKOR活性不足而影响结果，但是通过对维生素K依赖性凝血因子活性的检测发现，依靠肝细胞内源性VKOR能够实现维生素K循环催化的凝血因子羧化反应。

综上所述，本研究证实在肝细胞中过表达CYP4F2可导致维生素K依赖性FⅨa的活性降低。该结果将有助于进一步揭示CYP4F2基因与维生素K拮抗剂华法林出血关联性的相关功能机制。

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