铜绿假单胞菌在不同老年呼吸道感染中的生物学特性研究

赵铁梅，杨晓丹，苏宪灵

(解放军总医院呼吸内科，北京 100853)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性发作和机械通气相关肺炎(ventilator associated pneumonia，VAP)是常见的与生物被膜相关的呼吸道感染性疾病，铜绿假单胞菌为常见致病菌[1,2]。虽然铜绿假单胞菌在COPD 和VAP中都可以形成导致治疗困难的生物被膜，但COPD和VAP的疾病特点和发病情况各有差异：COPD 常呈慢性过程，而VAP常常为急性发病。那么，铜绿假单胞菌在这些感染中的生物学特性是否不同呢？绿脓菌素和弹性蛋白酶是铜绿假单胞菌重要的毒力因子，与肺部感染密切相关，那么，铜绿假单胞菌在COPD和VAP中的毒力是否也不同呢？为解决上述疑问，我们收集了COPD和VAP患者呼吸道标本分离得到的铜绿假单胞菌进行细菌生物被膜形成能力和主要毒力因子的检测。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2012年1月至2014年3月解放军总医院呼吸内科收治的COPD急性发作和VAP患者(>60岁)的呼吸道标本(合格痰标本、经气道吸引物、肺泡灌洗液)分离得到的铜绿假单胞菌共 48株。除外COPD患者发生VAP期间分离到的菌株。分为两组：COPD组(n=22)和VAP组(n=26)。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 主要试验仪器为比浊仪(bioMerieux公司，法国)和RT-6000全自动酶标仪(雷杜公司，美国)。胰酶大豆肉汤(tryptic soy broth，TSB)和MH肉汤(Muller-Hinton broth，MHB)均购自美国BD公司，结晶紫购自国药集团化学试剂有限公司，弹性蛋白酶-刚果红购自Sigma公司，0.1 mol/L Tris-HCl/l mmol/L CaCl2缓冲液购自Promega公司，甲醇、乙醇、蛋白胨、硫酸钾、氯化镁、无水氯化钙、三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸购自北京化学试剂公司。6孔聚苯乙烯平板购自美国Costar公司。

1.2.2 铜绿假单胞菌生物被膜形成能力的检测 参照Stepanovic等[3]的方法检测生物被膜的生成能力。铜绿假单胞菌在TSB中隔夜培养18 h，次日用TSB配制0.5 McFarland菌悬液，稀释至1.5×106CFU/ml，接种于96孔聚苯乙烯平板(0.2 ml)，TSB做阴性对照。培养24 h后，用250 μl无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗3次，99%甲醇固定后1%的结晶紫染色20 min，95%的乙醇作用10 min，吸出溶液至另一块96孔聚苯乙烯平板，酶标仪570 nm下检测吸光度(absorbance,A)值。重复检测3次，取平均值。参照Stepanovic等[4]的标准判断生物被膜的生成能力：临界值(ODc)=阴性对照平均值+(3×阴性对照标准差)。OD≤ODc：无生物被膜生成(-)；ODc4×ODc：生物被膜生成能力强(+++)。

1.2.3 绿脓菌素检测[5]细菌在LB培养液(950 ml去离子水+胰化蛋白胨10 g+酵母提取物5 g+氯化钠10 g)中培养16 h，离心后收集菌体，用新鲜PB培养液(含2%蛋白胨、1%硫酸钾和0.14%氯化镁)洗涤，悬浮,A600 nm=0.05，继续培养16～18 h后，用新鲜PB培养液稀释至A600 nm=0.05。于新鲜PB培养液加入5 ml 细菌悬液，37℃恒温培养箱200转/min振荡孵育24 h。取上述细菌悬液5 ml加入3 ml氯仿，振荡混匀，静置15～30 min，再以12 000 g离心20 min，将氯仿层转入新试管，加入1 ml 0.2 mol/L的盐酸，轻轻振荡混匀，静置15 min，取上层红色水相100 μl，在520 nm处测A值。计算绿脓菌素浓度(μg/ml)=A520 nm×17.072。

1.2.4 弹性蛋白酶活性的测定[6]挑取新鲜生长的菌落接种于2 ml PTSB液体培养基(每1000 ml双蒸水中加人蛋白胨50 g、TSB 2.5 g，高压蒸汽灭菌20 min，冷却后置于4℃冰箱备用)中过夜增菌，比浊仪稀释至菌悬液为105CFU/ml，加入2 ml菌悬液于18 ml PTSB培养基中，37℃恒温振荡培养4 h。10 000 g 4℃离心15 min后，吸取上清液，用一次性滤器(0.45 μm)过滤除菌。15 ml振荡培养管中加入20 mg弹性蛋白-刚果红和1 ml反应缓冲液 (0.1 mol/L Tris-HCl/1 mmol/L CaCl2，pH 7.2)，之后加入 1.0 ml细菌培养物的过滤上清液，在37℃、250转/min振荡条件下恒温振荡反应18 h后，加入0.l ml 0.12 mol/L的乙二胺四乙酸终止反应，将反应物置于冰上。通过10 000 g 4℃离心20 min去除不可溶的弹性蛋白酶-刚果红，取上清。在495 nm处读取A值。背景A值为未加弹性蛋白酶-刚果红时的A495 nm值，酶-底物反应的A值减去背景A值，即为最终的A值。

1.3 统计学处理

应用STATA 8.0软件进行统计分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者一般资料

COPD组和VAP组获取呼吸道标本距离发病的时间分别为(7.3±5.3)d和(3.1±2.6)d，入院前90 d内应用过抗菌药物治疗者分别占54.5%(12/22)和84.6%(22/26)，两组患者均进行了抗菌药物治疗，应用具有抗假单胞菌活性药物者分别占90.9%(20/22)和100.0%(26/26)，疗程分别为(10.6±4.9)d和(16.4±7.7)d。COPD组患者入院前90 d内有住院史者达45.5%(10/22)，近1年急性发作≥1次者占68.2%(15/22)。VAP组患者存在基础疾病者占69.2%(18/26)，合并冠心病和(或)高血压病者占46.2%(12/26)，合并脑部疾病者占42.3%(11/26)。

2.2 两组生物被膜形成能力比较

各个菌株生物被膜形成能力差异较大，依据所得A值分为4个级别：无生物被膜生成(-)，生物被膜生成能力较弱(+)，生物被膜生成能力中等(++)和生物被膜生成能力强(+++)。两组生物被膜形成能力的差异无统计学意义(P>0.05；表1)。

2.3 两组绿脓菌素含量比较

各个菌株产生的绿脓菌素含量差异较大，按照检测量分为4个数量级：<2，2～4，4～6和>6 μg/ml，结果显示，两组绿脓菌素含量差异无统计学意义(P=0.824；表2)。

2.4 两组弹性蛋白酶含量比较

各个菌株产生的弹性蛋白酶含量差异较大，按照检测A495 nm值分为3个数量级：<0.1，0.1～0.6和>0.6，结果显示，两组弹性蛋白酶含量差异无统计学意义(P=0.967；表3)。

3 讨 论

铜绿假单胞菌是呼吸系统感染的常见分离菌，研究显示：4%～15% COPD 患者的呼吸道标本中可以分离到铜绿假单胞菌，约28.7%～34.7%的重度COPD急性发作是由铜绿假单胞菌所致[7,8]；26%的VAP是由铜绿假单胞菌所致[9]。虽然铜绿假单胞菌在COPD 和VAP中都可以形成生物被膜，但COPD和VAP的致病特点各有差异。在COPD患者中，铜绿假单胞菌常常由普通型转变为黏液型，长期定植在呼吸道，形成生物被膜，很难清除，一旦被膜内细菌转为足量游离菌或获得新的感染细菌，即会引起急性发作，感染呈慢性过程。相反，在VAP中，由于吸引操作及呼吸气流的剪切力使气管插管上的生物被膜解离，细菌播散到下呼吸道，常常引起急性感染，气管插管上的生物被膜细菌成为VAP的巨大致病菌储存库[10]。目前国内外对引起上述感染的铜绿假单胞菌的生物学特性研究较少，病例数也较少。西班牙学者Martínez-Solano等[11]研究了13例 COPD急性发作分离到的铜绿假单胞菌，结果显示：与重症监护病房中血培养分离到的菌株相比，铜绿假单胞菌可以在某些COPD患者呼吸道中长期存在，在此过程中细菌形态可以发生变化，生物被膜形成能力增加但毒力下降。美国学者Fricks-Lima等[12]比较了6例VAP患者和3例肺囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)患者分离到的铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力，结果显示各个VAP患者中分离到的铜绿假单胞菌生物被膜形成能力均较强， 显著高于CF患者。但国内外文献中尚无铜绿假单胞菌在COPD 和VAP中生物被膜形成能力和细菌毒力对比的报道。我们针对此方面进行的研究结果显示： COPD组与VAP组相比，铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力无显著性差异；但各组的细菌生物被膜形成能力存在个体差异。

表1 两组铜绿假单胞菌生物被膜形成能力比较

-: non biofilm formation abilities; +: weak biofilm formation abilities; ++: moderate biofilm formation abilities; +++: strong biofilm formation abilities. COPD: chronic obstructive pulmonary disease; VAP: ventilator associated pneumonia

表2 两组绿脓菌素含量比较

COPD: chronic obstructive pulmonary disease; VAP: ventilator associated pneumonia

表3两组弹性蛋白酶含量比较

Table 3 Production of elastase between two groups [n(%)]

Group nA495nm<0．1A495nm0．1-0．6A495nm>0．6COPD2218(81．8)2(9．1)2(9．1)VAP2622(84．6)2(7．7)2(7．7)

COPD: chronic obstructive pulmonary disease; VAP: ventilator associated pneumonia

绿脓菌素和弹性蛋白酶是铜绿假单胞菌重要的毒力因子[13,14]。CD-1小鼠的急性肺炎模型研究显示：小鼠不能清除野生型铜绿假单胞菌；但是小鼠可以清除绿脓菌素缺乏突变的铜绿假单胞菌的感染，与野生型铜绿假单胞菌相比，细菌负荷可以下降1000～10 000倍[15]。弹性蛋白酶可以破坏机体组织的完整性，影响宿主的免疫系统。缺乏弹性蛋白酶的突变株与原菌株相比，更容易被清除。我们的研究显示：铜绿假单胞菌重要的毒力因子绿脓菌素和弹性蛋白酶的含量在COPD组与VAP组间差异无统计学意义，但存在个体差异。

综上所述，铜绿假单胞菌感染后，其在COPD 和VAP中的生物被膜形成能力及产生的主要毒力因子能力相似。但此结论尚需要大样本的研究去证实。

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