S1PR1/3介导骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的信号通路探讨

杨苑儒 周 璇 张若辰 李丽英 杨 乐*

(1.首都医科大学2013级医学实验技术专业, 北京 100069；2.首都医科大学基础医学院细胞生物学系，北京 100069)

·基础研究 ·

S1PR1/3介导骨髓间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的信号通路探讨

杨苑儒1周 璇1张若辰1李丽英2杨 乐2*

(1.首都医科大学2013级医学实验技术专业, 北京 100069；2.首都医科大学基础医学院细胞生物学系，北京 100069)

目的 在转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)诱导的分化模型中探讨RhoA信号对于磷酸鞘氨醇受体1/3(sphingosine 1-phosphate receptor 1/3， S1PR1/3)介导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell， BMSC)向肌成纤维细胞(myofibroblast， MF)分化的影响及其机制。方法 分离并培养小鼠原代BMSC，TGFβ1诱导其分化。采用qRT-PCR检测分化标志物平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin， αSMA)、Ⅰ型胶原[procollagen α1(Ⅰ),Col α1(Ⅰ)]和Ⅲ型胶原[Col α1(Ⅲ)]的mRNA表达；采用Pull-down试剂盒检测RhoA的活化。结果 TGFβ1能够显著上调BMSC细胞中分化标志物αSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表达，呈现剂量依赖效应。TGFβ1能够激活小G蛋白RhoA，该作用可以被S1PR1或S1PR3拮抗剂所阻断。RhoA抑制剂C3转移酶能够阻断TGFβ1诱导的αSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ) mRNA水平的上调。结论 RhoA信号参与了S1PR1/3介导的BMSC向MF的分化。

小鼠；骨髓间充质干细胞；磷酸鞘氨醇受体；RhoA

肝纤维化时骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)可以迁移至受损伤肝脏，分化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)，从而参与肝纤维化的发生[1-2]。研究显示[3-5]，磷酸鞘氨醇受体(sphingosine 1-phosphate receptor 1/3, S1PR1/3)参与了肝纤维化时BMSC向MF的分化；并且S1PR1/3和转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)信号通路之间存在cross-talk，TGFβ1通过上调BMSC中S1PR1和S1PR3的表达，诱导BMSC向MF的分化。但S1PR下游参与BMSC分化的信号通路尚不清楚。本实验以原代培养的小鼠BMSC为研究对象，以S1PR1/3和RhoA为靶分子，拟在TGFβ1诱导的分化模型中探讨RhoA信号对于S1PR1/3介导的BMSC向MF分化的影响及其机制。本研究有助于阐明S1PR1/3在肝纤维化治疗中的具体作用机制，为肝纤维化以S1PR1/3为靶位点进行治疗，提供新的思路和理论依据，具有重要的理论意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1)动物：普通ICR雄性小鼠，体质量28～30 g，SPF级，周龄6周左右，购于首都医科大学实验动物部。实验动物许可证号：SYXK(京)2015-0012。

2)细胞：原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞，本实验室已建立其分离与培养方法。

3)主要仪器：细胞培养箱(Thermo公司，美国)，离心机(5810R，Eppendorf 公司，美国)，Real-time PCR仪(ABI 7300，ABI公司，美国)，垂直电泳装置(Bio-Rad公司，美国)，蛋白转印装置(Biometra公司，德国)，Odyssey 红外荧光扫描成像系统(LI-COR公司，美国)，荧光显微镜(Leica公司，日本)。

4)主要试剂：a-MEM培养基(Gibco公司，美国)，胎牛血清(Biochrom公司，美国)，TGFβ1(PeproTech公司，美国)，抗平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle αctin， aSMA)，单克隆抗体(Sigma公司，美国)，Cy3羊抗鼠二抗(Jackson Immunoresearch公司，美国)，红外荧光染料标记的二抗(LI-COR公司，美国)，RNeasy Mini Kit(Qiagen公司，德国)，M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，美国)，Pull-down检测试剂盒(Thermo Scientific公司，美国)。

1.2 方法

1)小鼠BMSC的分离与培养：无菌条件下取出小鼠四肢长骨，浸入预热的PBS溶液中，去除肌肉筋膜和骨骺，以a-MEM培养基作为骨髓冲洗液，用1 mL的一次性注射器将骨髓细胞冲至细胞培养皿中。细胞悬液过400目筛网后用完全培养基[20% (体积分数)胎牛血清的a-MEM]悬浮细胞，接种到新的细胞培养皿中置于37 ℃，5% (体积分数) CO2培养。24 h后全量换液，之后每3 d半量换液1次，去除未贴壁细胞，待细胞长满后进行传代，即为P1代。传代后采用15%(体积分数) 胎牛血清的a-MEM培养基继续培养。

所有动物实验均遵循2006年国家科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》和相关伦理学规范。

2)小鼠BMSC的分化：BMSC汇合度达到80%～90%后，PBS冲洗1次，更换无血清培养基培养24 h，然后加入0.2、1、2、10 ng/mL TGF-β1，同时设置对照组，处理细胞24 h后收集细胞，提取总RNA进行实时荧光定量聚合酶链反应，检测平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin，αSMA)、Ⅰ型胶原[procollagen α1(Ⅰ) ，Col α1(Ⅰ)] 和Ⅲ型胶原[Col α1(Ⅲ)]的mRNA水平。

3)实时荧光定量聚合酶链反应：处理后的细胞用预冷PBS清洗，加入350 μL裂解液，收集裂解底物提取全细胞RNA，定量后取0.5g反转录(不加反转录酶作为阴性对照，即NO-RT)，cDNA稀释后进行PCR反应(引物序列详见表1)。检测的临界点设定在PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(Ct)作为模板初始浓度的间接指标，溶解曲线分析采用默认条件。结果以18S rRNA进行校正，用ΔΔCt法计算相对基因表达量。

表1 PCR引物序列

Col α1Ⅰ： procollagen α1Ⅰ; αSMA:smooth muscle actin.

4)蛋白质印迹实验(Western blotting):在4 ℃条件下加入裂解液，提取小鼠BMSC中的蛋白质，用BCA Protein Assay Kit测定样品蛋白质的量。每个样本取30 μg蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并转至PVDF膜上，用含5%(质量分数)脱脂奶粉的TBST溶液室温1 h，加入1∶500稀释倍数的αSMA抗体于4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗，室温孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min，直接用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行扫描成像。内参采用相同步骤。

5)活化的RhoA Pull-down分析：BMSC细胞经过相应的处理之后，经裂解液裂解，检测RhoA的GTP结合形式，最后用Western blotting展示条带。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 TGFβ1诱导小鼠BMSC分化，呈剂量依赖效应

不同浓度TGFβ1刺激BMSC 24 h后，分化标志物aSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表达显著上调，其中在10 ng/mL TGFβ1处理下表达量达到最大，呈现剂量依赖效应。详见图1。

图1 不同浓度TGFβ1处理BMSC 24 h后 mRNA表达

A:αSMA; B:Col α1(Ⅰ); C:Col α1(Ⅲ); BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell; αSMA:α-smooth muscle actin; Col α1: procollagen α1; TBFβ1: transforming growth factor β1;*P<0.05vs0 ng·mg-1TGFβ1.

2.2 TGFβ1激活小G蛋白RhoA

10 ng/mL TGFβ1分别刺激BMSC 5、15和30 min，然后通过Pull-down分析实验检测与GTP结合的RhoA蛋白。结果显示，TGFβ1能够快速激活RhoA，且其活化水平在30 min时达到最大。详见图2。

2.3 阻断S1PR1或S1PR3抑制活化的RhoA

预先用S1PR1拮抗剂W146或S1PR3拮抗剂CAY10444预孵育BMSC 1 h，然后使用10 ng/mL TGFβ1刺激细胞30 min，观察GTP-RhoA的蛋白变化。结果显示，TGFβ1诱导的RhoA活化能够被S1PR1或S1PR3拮抗剂所抑制(P<0.05)。详见图3。

2.4 BMSC的分化依赖于RhoA信号通路

用RhoA 抑制剂C3转移酶预孵育BMSC 1 h，然后使用10 ng/mL TGFβ1刺激细胞24 h，检测分化标志物aSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表达。结果显示C3转移酶可以阻断TGFβ1诱导BMSC分化。详见图4。

图2 TGFβ1刺激能够激活小G蛋白RhoA

BMSCs were exposed to 10 ng/mL TGFβ1 at 5, 15 and 30 minutes. Total and activated RhoA in BMSCs were determined by pull-down assay.*P<0.05vs0 min; TBFβ1: transforming growth factor β1; BMSC:bone marrow mesenchymal stem cell.

图3 S1PR1/3拮抗剂对于RhoA活化的影响

BMSCs were incubated with S1PR1 antagonist W146 (10 mmol/L) or S1PR3 antagonist CAY10444 (10 mmol/L) prior to TGFβ1 treatment (10 ng/mL, 30 min). Total and activated RhoA in BMSCs were determined by pull-down assay.*P<0.05vscontrol cells;#P<0.05vsTGFβ1-treated cells alone；TBFβ1: transforming growth factor β1； S1PR1/3： sphingosine 1-phosphate receptor 1/3； BMSC: bone marrow mesenchymal stem cell.

3 讨论

肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，肝脏肌成纤维细胞在肝纤维化发生和发展过程中起着决定性作用[6-7]。MF异源性的观点已被学者普遍接受。前期工作[3-5]已证实，在肝纤维化发生过程中BMSC是MF的重要来源，且S1PR1和S1PR3参与了BMSC向MF的分化，然而与受体S1PR1和S1PR3结合后的下游信号通路，如MAPK、PI-3K、Akt、Rho、cAMP、和Ca2+等相关的信号途径在BMSC分化中的作用，尚不清楚。Rho蛋白属于小G蛋白超家族的亚家族成员，具有GTP酶活性，在信号传导过程中起到分子开关的作用[8-9]。其家族内的代表性成员RhoA及其效应物ROCK的激活可以影响细胞的分化命运。当抑制RhoA/ROCK活性时，干细胞可以向软骨细胞或脂肪细胞分化，而当激活它时，则促进了成骨分化[10]。本研究首次证实RhoA信号参与S1PR1/3介导的BMSC向MF的分化。本课题组的结果表明TGFβ1刺激(5、15和30 min)能够上调活化形式RhoA的表达。并且，用拮抗剂把S1PR1或S1PR3特异性抑制以后能够阻断TGFβ1诱导的RhoA活化。此外，RhoA抑制剂C3转移酶可以阻断TGFβ1诱导的aSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ) mRNA表达上调，从而抑制BMSC分化。

图4 TGFβ1通过RhoA信号通路诱导BMSC分化

A:expression of aSMA mRNA; B: expression of Col α1(Ⅰ) mRNA; C: expression of Col α1 (Ⅲ) mRNA; The effect of C3 transferase (Rho A inhibitor) on BMSC differentiation was examined by qRT-PCR. TBFβ1: transforming growth factor β1； BMSC: bone marrow mesenchymal stem cell;Col α1: procollagen α1；*P<0.05vsuntreated control cells;#P<0.05vsTGFβ1-treated cells alone.

已有文献[11]报道在不同细胞中S1P/S1PR和TGFβ1之间存在某种 cross-talk，但是它们在BMSC分化过程中的相互作用还不清楚。本研究在体外培养小鼠原代BMSC，然后用TGFβ1诱导分化，通过qRT-PCR检测MF标志物——αSMA、Col α1(Ⅰ)和Col α1(Ⅲ)的mRNA表达，证明TGFβ1能够诱导BMSCs向MF的分化。进而使用S1PR拮抗剂，进一步证实TGFβ1诱导BMSC分化为MF这一过程依赖于S1PR1和S1PR3。这与已发表的研究[11-12]结果相一致，有文献[13]报道TGFβ1诱导成纤维细胞和肌原细胞的分化也依赖于S1P/S1PR信号轴，从而进一步确证S1P/S1PR和TGFβ1信号通路之间的cross-talk。

国内外对于骨髓干细胞的治疗潜能进行了广泛的研究并取得了长足的进展，在临床肝硬化病人进行骨髓干细胞移植治疗尝试也取得了令人鼓舞的效果[14-15]。但是，实验[1]表明，肝纤维化发生过程中产生细胞外基质的主要细胞MF，除了肝星状细胞和成纤维细胞激活以及上皮细胞间质转化外，至少还有部分来自于骨髓干细胞。本研究也证实了BMSC可以分化为MF从而参与肝纤维化的发生。因此，本课题组的研究结果提示在BMSC应用于治疗肝硬化等疾病时不应低估它可能会分化为MF，从而促进纤维化发生的潜能。

总之，本研究探讨了RhoA信号在S1PR1/S1PR3介导BMSC向MF分化过程中的重要作用，这可能是S1PR1/3发挥促炎和促纤维化作用的主要机制。阐明这一机制将有助于制定新的特异的抗纤维化治疗方案，具有重要的理论意义和应用价值。

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编辑 孙超渊

Signaling of bone marrow mesenchymal stem cell differentiation to myofibroblasts mediated by S1PR1/3

Yang Yuanru1, Zhou Xuan1, Zhang Ruochen1, Li Liying2， Yang Le2*

(1.Grade2013MedicalLaboratoryAnimalScience,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069; 2.DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective Aim of this study is to explore the role of RhoA in transforming growth factor β1 (TGFβ1)-induced bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) differentiation to myofibroblast (MF) mediated by sphingosine 1-phosphate receptor 1/3 (S1PR1/3). Methods Serum-starved primary cultured mouse BMSCs were stimulated by a series dose of TGFβ1. Expression of α-smooth muscle actin (αSMA), procollagen α1(Ⅰ) [Col α1(Ⅰ)] and procollagen α1(Ⅲ) [Col α1(Ⅲ)] was measured by qRT-PCR. Activated RhoA induced by TGFβ1 in BMSCs was determined by Pull-down assay. Results TGFβ1 induced an up-regulation of αSMA, Col α1(Ⅰ) and Col α1(Ⅲ) mRNA levels in BMSCs. TGFβ1 triggered the activation of RhoA, which can be blocked by S1PR1/3 antagonists. RhoA inhibitor C3 Transferase reversed the up-regulation of αSMA, Col α1(Ⅰ) and Col α1(Ⅲ) mRNA expression induced by TGFβ1. Conclusion RhoA is involved in the differentiation of BMSC to MF induced by TGFβ1.

mouse; bone marrow mesenchymal stem cell; sphingosine 1-phosphate receptor; RhoA

北京市自然科学基金(7164237)，北京市优秀人才培养资助(2014000020124G156)。This study was supported by Natural Science Foundation of Beijing (7164237),Beijing Municipal Foundation for the Excellent Talents (2014000020124G156).

时间：2017-04-13 19∶54

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1954.030.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.022]

Q2

2016-06-02)

*Corresponding author， E-mail：yangle@ccmu.edu.cn