来曲唑联合高脂饲料建立PCOS-IR大鼠模型实验研究

蔡 云 许 昕

(首都医科大学附属北京中医医院妇科，北京 100010)

·基础研究 ·

来曲唑联合高脂饲料建立PCOS-IR大鼠模型实验研究

蔡 云 许 昕*

(首都医科大学附属北京中医医院妇科，北京 100010)

目的 采用两种不同喂养时间的来曲唑联合高脂饲料方法，建立多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(polycystic ovary syndrome with insulin resistance, PCOS-IR)大鼠模型，分析两种模型各自的内分泌和代谢特征。方法 将18只6周龄SD雌性大鼠采用数字表法随机分为3组：对照组、来曲唑A组和来曲唑B组，每组各6只。对照组予普通饲料喂养，每日灌胃0.5%(质量分数)羧甲纤维素钠溶液；来曲唑A组连续21 d灌胃来曲唑溶液，同时给予高脂饲料喂养；来曲唑B组连续30 d灌胃来曲唑溶液，并给予与来曲唑A组相同的高脂饲料喂养。观察3组大鼠的体质量和卵巢组织学变化，测定血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、睾酮(testosterone，T)、三酰甘油(triglyceride，TG)和空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)等浓度，计算LH/FSH比值和胰岛素抵抗指数(homeostasis model of assessment for insulin resistence index, HOMA-IR)。结果 与对照组比较，来曲唑A组大鼠体质量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，性激素及代谢等指标较对照组有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。来曲唑B组大鼠的体质量亦有明显增加(P<0.05)，卵巢呈多囊样改变，血清T、LH/FSH显著升高(P<0.01)，同时，三酰甘油、空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、空腹胰岛素和HOMA-IR值均显著升高(P<0.01)。结论 来曲唑联合高脂饲料喂养30 d可成功诱导出多囊卵巢综合征胰岛素抵抗大鼠模型；与同法喂养21 d的模型相比，其内分泌与代谢指标改变更符合人PCOS-IR的临床病理特征。

多囊卵巢综合征；胰岛素抵抗；来曲唑；高脂饮食

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是妇科常见的内分泌与代谢功能异常的复杂性疾病，以持续无排卵或稀发排卵、高雄激素和/或高胰岛素血症、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)为特征，表现为月经稀发、闭经、不孕、肥胖、多毛、痤疮等[1-2]。据统计，国外育龄期女性PCOS发病率高达20%[3]，中国发病率约为5%～10%[4]。PCOS不仅严重影响病人的生殖功能，还存在糖尿病、代谢综合征、心血管疾病、子宫内膜癌等远期合并症的发病风险，因此在最近十五、六年间引起医学界的高度重视。已有研究[5]证实，PCOS病人广泛存在胰岛素抵抗，后者作为PCOS的基本病理特征，是本病发生发展和转归至关重要的一环。多囊卵巢综合征胰岛素抵抗(polycystic ovary syndrome with insulin resistance, PCOS-IR)是目前妇科内分泌领域研究的热点之一，也是较为棘手的难题。建立一种理想的PCOS-IR动物模型，以用于相关研究和指导临床治疗具有重要意义。本研究采用来曲唑联合高脂饲料诱导雌性SD大鼠建立PCOS-IR模型，分析其内分泌和代谢特征，旨在寻找一种简便有效、更加符合人体PCOS-IR病理特征的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取6周龄SPF级SD大鼠18只，体质量150～160 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0004。将18只大鼠按体质量排序，采用数字表法，将它们随机分为：对照组、来曲唑A组、来曲唑B组，每组各6只。

1.2 实验用药

来曲唑(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：HI9991001)，用0.5%(质量分数)羧甲纤维素溶液配成所需浓度[来曲唑1 mg·kg-1·d-1溶于0.5%(质量分数)羧甲纤维素钠]；羧甲纤维素钠(安徽山河药用辅料股份有限公司，批号：160301)。

1.3 实验试剂

血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)和三酰甘油(triglyceride，TG)等放射免疫试剂盒，均由北京北方生物技术研究所有限公司提供；空腹血糖(fasting plasma glucose， FPG)由罗氏活力型血糖仪(德国罗氏诊断有限公司)测定。

1.4 造模方法

所有实验大鼠适应性喂养2 d，对照组给予普通饲料喂养，每日灌胃0.5%(质量分数)羧甲纤维素钠溶液；来曲唑A组连续21 d，每日灌胃来曲唑溶液[来曲唑1 mg·kg-1·d-1溶于0.5%(质量分数)羧甲纤维素钠]，同时给予高脂饲料喂养(配方：普通饲料61.5%、猪油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、鸡蛋10%、麻油1%、食盐0.5%)；来曲唑B组与A组每日灌胃来曲唑溶液的剂量、浓度和高脂饲料喂养方法相同，只延长灌胃和饲养时间，连续30 d。

1.5 检测指标

1.5.1 大鼠体质量增长情况

每周定时测量大鼠体质量并记录数据，绘制大鼠体质量增长变化曲线。

1.5.2 性激素与代谢指标

各组大鼠灌胃结束后，禁食24 h，于次日以2%(质量分数)戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，离心后收集血清。血清性激素(T、FSH、LH、E2)及相关代谢指标(FINS、FPG、TG)均采用放射免疫法测定，严格按照试剂盒说明书操作。计算LH/FSH比值和胰岛素抵抗指数(homeostasis model of assessment for insulin resistence index, HOMA-IR)[计算公式：HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5]。

1.5.3 卵巢组织学观察

卵巢组织以4%(体积分数)多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋；以4μm厚度切片，常规脱蜡、水化后苏木素染色5～10 min；1%(体积分数)盐酸乙醇分化，1%(质量分数)伊红溶液染色，脱水，透明中性树胶封片，显微镜下观察各组大鼠卵巢组织学变化。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

所有实验大鼠经灌胃后，无震颤、惊厥、流涕、呼吸困难等异常生命特征，大鼠外观皮毛光泽，试验周期内无一只大鼠死亡，其饮食、活动等均无显著异常状况。

2.2 大鼠体质量的变化

3组大鼠实验开始前的体质量差异无统计学意义。来曲唑灌胃的两组大鼠体质量，于喂养第8天开始明显增加，喂养至第22天，两组来曲唑灌胃大鼠与对照组比较，体质量增长幅度大，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1和图1。

表1 3组大鼠体质量比较

GroupDay1Day22Control162．17±3．97247．01±9．01LetrozoleAgroup164．82±5．55309．95±6．40∗LetrozoleBgroup165．10±5．76305．41±11．62∗

*P<0.05vscontrol

图1 3组大鼠体质量增长趋势图

2.3 性激素浓度变化差异

3组大鼠相比，FSH及E2值变化差异无统计学意义(P>0.05)；从黄体生成激素、LH/FSH、睾酮等性激素指标看，来曲唑A组与对照组相比差异无统计学意义；但来曲唑B组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，来曲唑B组与来曲唑A组比较，差异也有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.4 代谢指标的变化

与对照组相比，来曲唑A组TG的量差异无统计学意义(P>0.05)；来曲唑B组TG显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

与对照组相比，来曲唑A组FPG浓度有升高，差异有统计学意义(P<0.05)；来曲唑B组FPG浓度显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表3。

与对照组相比，来曲唑A组FINS升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；来曲唑B组FINS显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；来曲唑B组与来曲唑A组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

与对照组相比，来曲唑A组HOMA-IR指数差异无统计学意义(P>0.05)；来曲唑B组HOMA-IR差异有统计学意义(P<0.01)；来曲唑B组与来曲唑A组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

2.5 卵巢组织学改变

光镜下可见，对照组大鼠卵巢有多个黄体，颗粒细胞呈多层，形态完整，排列整齐，颗粒细胞层较厚(图2A)。来曲唑A组(图2B)和B组(图2C)可见早期发育的较多的小卵泡及闭锁卵泡，囊状扩张明显增加，颗粒细胞层数减少，甚至消失，较少黄体，卵巢呈多囊样改变。

3 讨论

PCOS-IR是妇科内分泌代谢方面的热点课题，姚元庆等[6]根据Carmiona的研究结果估计PCOS病人胰岛素抵抗的发生率高达50%～70%。IR导致高胰岛素血症、肥胖、无排卵等病理变化，后者又加重IR，形成恶性循环，使PCOS病理机制不断复杂演变而最终导致糖尿病、代谢综合征等远期合并症，给病人带来较大身心伤害[7]。建立PCOS-IR动物模型进行基础实验研究对指导临床治疗和维护生命全周期健康具有重大意义。目前国内常见的PCOS-IR造模方法主要包括有：脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)皮下注射[8]，丙酸睾丸酮联合高脂饲料[9]，注射硫酸普拉睾酮钠[10]，皮下埋植避孕棒加人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)注射[11]等，虽然方法众多但并不完善成熟，有的造模药物(硫酸普拉睾酮钠)不易得到；有的注射油剂容易造成皮下结节；有的造模后卵巢组织学改变与疾病不符，如笔者之前预实验采用丙酸睾丸酮联合高脂饲料造模，结果卵巢体积反而变小，无明显多囊样改变，分析可能与外源性雄激素抑制卵巢功能有关。

表2 3组大鼠性激素指标比较

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsletrozole A group. FSH:follicle stimulating hormone; LH:luteinizing hormone; T:testosterone; E2:estradiol.

表3 3组大鼠代谢指标比较

*P<0.05，**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsletrozole A group. TG:triglyceride; FPG:fasting plasma glucose; FINS:fasting insulin; HOMA-IR:homeostasis model of assessment for insulin resistence index.

图2 卵巢组织变化

A: control; B: letrozole A group; C:letrozole B group. Ovarian granulosa cells in the control were complete and thick; In letrozole groups， there were many small follicles, granulosa cells have decreased.

本实验采用来曲唑联合高脂饲料方法造模。芳香化酶是雄激素向雌激素转化的最后一步限速酶，卵巢内的芳香化酶活性下降可导致雄激素浓度升高，来曲唑作为芳香化酶抑制剂，可阻止体内雄激素向雌激素的转换，使雄激素升高，并进展成为多囊卵巢[12]。高脂饮食是诱导肥胖症和胰岛素抵抗的常用方法。王晓珂[13]的研究表明，高脂饲料引起脂肪组织巨噬细胞的聚集和炎性反应增加，从而干扰胰岛素的信号传导通路导致胰岛素抵抗的发生。杨宇峰等[14]研究表明，高脂饮食能直接降低胰岛素作用下骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的吸收作用，同时提高肝脏葡萄糖的生成，改变对胰岛素敏感组织内葡萄糖的转变规律，从而导致机体糖代谢紊乱和胰岛素抵抗。以上是本次造模实验的理论基础。

本研究表明，采用来曲唑联合高脂饲料喂养30 d(来曲唑B组)，大鼠体质量明显增加，卵巢呈多囊样改变，血清T浓度、LH/FSH比值均明显升高，血清胰岛素浓度和HOMA-IR值也显著升高，符合人PCOS-IR的病理改变；说明该方法能成功诱导PCOS大鼠出现胰岛素抵抗。根据文献[15]报道所设置的来曲唑A组，造模时间较短(21 d)，虽然其血清T、LH/FSH比值及FINS、HOMA-IR等各项指标均较对照组有所升高，但差异无统计学意义。来曲唑B组按照大鼠灌胃来曲唑溶液联合高脂饲料喂养的方法不变，只延长动物喂养时间至30 d，除性激素和脂代谢等病理特征之外，也与人PCOS-IR病程长久的临床特征相符。研究结果证实，来曲唑联合高脂饲料喂养30 d可成功诱导出理想的PCOS-IR大鼠模型。

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编辑 陈瑞芳

Experimental study on establishment of rat model of polycystic ovary syndrome with insulin resistance by letrozole combined with high fat diet

Cai Yun，Xu Xin*

(Departmentofgynecology,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China)

Objective To establish a rat model of polycystic ovary syndrome with insulin resistance (PCOS-IR) by using two different types of letrozole combined with high fat diet for different periods of time to analyze their endocrine and metabolic characteristics. Methods Eighteen 6-week-old female SD rats were randomly divided into 3 groups：control, the letrozole A group and the letrozole B group. The rats in control were fed with 0.5% carboxymethylcellulose solution daily. The rats in group A received letrozole for 21 consecutive days and fed with high-fat diet. Group B received letrozole for 30 days, feeding with high fat diet. The levels of follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), testosterone (T), triglyceride (TG) and fasting insulin (FINS) were measured and the changes of body weight and ovarian histology were observed. LH/FSH ratio and insulin resistance index (HOMA-IR) were calculated. Results Compared with the control, the body weight of letrozole A group increased significantly(P<0.05). The sex hormones and metabolic indexes were higher than that in the control (P<0.05), but there was no statistically significant difference (P>0.05).The weight of rats in group B was significantly higher than that in the control (P<0.05). The levels of T,LH/FSH,TG, FPG, FINS and HOMA-IR were significantly increased (P<0.01). Conclusion Letrozole combined with high fat diet for 30 days can successfully induce a rat model of polycystic ovary syndrome with insulin resistance.

polycystic ovary syndrome; insulin resistance; letrozole; high-fat diet

国家自然科学基金(81674010)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81674010).

时间：2017-04-13 19∶40

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1940.016.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.018]

R711.75

2017-01-17)

*Corresponding author， E-mail：xuxindoudou1959@163.com