刺薏复方不同制备物对辐射后小鼠外周血白细胞的影响＊

伍明江，敖 静，周 敏，蒋朝晖，吴晓黎

刺薏复方不同制备物对辐射后小鼠外周血白细胞的影响＊

伍明江，敖 静，周 敏，蒋朝晖，吴晓黎

目的 比较刺薏复方不同提取方法制备的药物对辐射损伤模型小鼠外周血白细胞的影响。方法 分别用水和75%乙醇溶液对刺薏复方中药物进行提取，以干浸膏得率和刺五加中紫丁香苷作为提取考察指标，并将不同制备所得的干浸膏按处方比灌胃BALB/c小鼠14 d后，以4GY Co60γ射线一次性全身照射，比较小鼠照射前、照射后第3天、照射后第14天外周血白细胞的变化。结果 刺薏复方水提取干浸膏得率和紫丁香苷含量均较75%乙醇提取要高，乌梅单独水提取按处方比加入复方水提取灌胃小鼠，能显著增加辐射损伤模型小鼠外周血白细胞数的作用。结论 刺薏复方以乌梅单独水提取并加入复方水提取的方法能显著增加辐射后外周血白细胞总数。

刺薏复方；提取；抗辐射；外周血白细胞

辐射是一种新型污染，人体长期受到辐射，会使造血系统细胞受损，导致外周血白细胞减少，机体免疫功能下降，甚至机体的蛋白质、核酸、酶、染色体发生畸变［1，2］，造成对多个系统的危害［3］，特别是对男性生殖系统有较大影响［4］。人体遭受辐射后出现疲乏无力、头昏眩晕、五心烦热等症状。中医学认为是热盛伤阴、津液受损、气血不和、脾胃失调、耗气伤血及肝肾亏损，因而提出了运用复方制剂进行清热解毒、生津润燥、凉补气血、健脾和胃、滋补肝肾的治疗原则，以达到对机体整体调理的目的［5］。

刺薏复方由贵阳中医学院第一附属医院资深中医专家根据长期治疗肿瘤、血液病、体虚的临床经验和现代医药研究进展组成的方剂。该方由刺五加、薏苡仁、酸枣仁、乌梅等药物组成。刺五加为君，能益气健脾，温阳补肾，培补先天，培其生命之本；以薏苡仁为臣，健脾利湿，培养后天之本，健脾胃、强气血，有生化之源；酸枣仁养心安神，安心神定，睡眠充足，脾肾功能运转正常，脾肾二脏相辅相成，气旺精足，用之为佐；乌梅用其收敛之性，止其汗，用其酸味开胃生津，用之为使。据报道，该方中刺五加、薏苡仁等药物均有不同程度的抗辐射辅助保护作用，整方注重从提高机体免疫功能来达到抗辐射辅助保护作用［6-10］。

基于刺薏复方抗辐射的有效作用，本研究从后续拟开发的有关刺薏复方抗辐射制剂角度考虑，重点考察刺薏复方不同提取方法浸膏得率以及所配比药物对辐射外周血白细胞的影响，通过不同提取方法有关指标考察和外周血白细胞恢复作用的实验研究，以期确定刺薏复方的提取方法以及增加辐射后外周血白细胞的药物配比。本研究旨在为刺薏复方及其抗辐射有关制剂的开发应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料动物为BALB/c小鼠，重量（20±2）g，雌性，一级清洁动物，由中国科学院上海实验动物中心提供。实验药物为刺五加、薏苡仁、酸枣仁、乌梅，均购买于贵阳市中药材市场。各药材均经贵州省药检所林开中老师鉴定；紫丁香苷对照品购买于中国药品生物制品检定所，批号：111574-200502；螺旋藻片购买于南宁健星生物技术有限公司，批准文号：南卫食字［2004］第20180号。主要试剂为乙醇、甲醇，均购买于天津市康科德科技有限公司，白细胞稀释液自制（冰醋酸2.0ml、1%甲紫，蒸馏水加至100ml），5%火棉胶，消毒碘酒等。主要仪器为GWGP 80型钴-60治疗机（中国核动力院设备制造厂），Agilent 1100高效液相色谱仪 （美国安捷伦科技有限公司），洁净动物饲养柜（苏杭实验动物发展科技发展公司），CX31光学显微镜 （日本Olympus公司）等。

1.2 实验方法

1.2.1 药物制备 以传统用药方法为提取的基本依据，对刺薏复方进行水和75%乙醇提取。但基于乌梅中含有大量有机酸，具有较强的酸性（经测试：乌梅8倍量水提液pH=3，其他药物提取液为中性），与复方中其他药物一起提取可能会造成有效成分的酸水解，因此，考察了乌梅另行提取的方案。水提取或75%乙醇提取均检测了刺五加中紫丁香苷的含量。

提取方法有两种：（1）水煎煮提取。分别将刺薏复方四味药，刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药，乌梅一味药三组药物进行水煎煮2次，3 h/次。第1次加10倍量水，过滤，药渣第2次加8倍量水，过滤，将2次滤液合并，3000 rpm离心15min，分离上清液，水浴蒸干浓缩，再减压干燥成干浸膏，即得。（2）75%乙醇回流提取。分别将刺薏复方四味药，刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药，乌梅一味药三组药物加75%乙醇回流提取2次，第1次加8倍量75%乙醇，回流提取12 h，过滤，药渣第2次加5倍量75%乙醇，回流提取3 h，过滤，将2次滤液合并，3000 rpm离心15min，分离上清液，减压浓缩，再干燥成干浸膏，即得。

干浸膏得率按“干浸膏重量/药材重量×100%”进行计算，从不同提取方法可以看出水煎煮所得干浸膏明显高于75%乙醇回流提取所得干浸膏，见表1。

紫丁香苷的含量测定：（1） 色谱条件。20RBAXSB-C18色谱柱，以甲醇∶水（18∶82）为流动相，检测波长265 nm，柱温40℃。（2）标准品的制备。取紫丁香苷对照品适量，精密称定，用50%甲醇溶解，制成80μg/mL的溶液，即得。（3）样品处理。分别称取含有刺五加的干浸膏样品0.1 g，加10ml 50%的甲醇溶解，超声提取30min，取上清液10 000 rpm离心10min，过0.45μm滤膜，即得。（4）检测结果。紫丁香苷是刺五加中成分，故未对乌梅干浸膏测定。从结果可以看出，刺五加、薏苡仁、酸枣仁水提取干浸膏中紫丁香苷含量最高，见表1。

表1 不同提取组分在水和75%乙醇提取的干浸膏得率及紫丁香苷含量

1.2.2 外周血细胞计数实验［11］（1）动物分组。BALB/c小鼠64只，随机分成8组，即A组为辐射模型对照组（生理盐水组），B组为阳性药物对照组（螺旋藻片组），C组为刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药水提取干浸膏组，D组为刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药水提取干浸膏另加乌梅水提取干浸膏组，E组为刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药75%乙醇提取干浸膏组，F组为刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药75%乙醇提取干浸膏另加乌梅75%乙醇提取干浸膏组，G组为刺薏复方四味药水提取干浸膏组，H组为刺薏复方四味药75%乙醇提取干浸膏组，每组小鼠8只。（2）给药剂量。小鼠给药量按成人剂量的15倍计，即按“成人生药材处方量×干浸膏得率×15/ 60”进行计算，各组给药量见表2。螺旋藻片按成人剂量15倍的给药量为1.13 g/kg）（螺旋藻片成人剂量是9片/d），灌胃时将药物用饮用水溶解。（3）给药方式。动物于洁净动物饲养柜中适应性饲养1周后开始给药，于每天上午给药1次，照射前给药14 d，照射后给药14 d。（4）造模方法。以Co60γ射线按4GY剂量全身照射小鼠一次，引起小鼠辐射损伤。

1.2.3 样品采集和计数方法 分别于实验照射前、照射后第3天，照射后第14天三次采尾部末梢血10μl，每次采血后用5%火棉胶涂抹小鼠的尾部，将采取的血立即加入到装有490μl的白细胞稀释液的试管中，充分混匀后加入到血球计数板中于显微镜下进行计数。

1.3 数据处理数据采用SPSS 18.0统计分析，结果采用均数±标准差（±s）表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

按 “四个大方格中白细胞总数/4×稀释倍数× 107”计算血球计数板中白细胞总数，结果如表2和图1显示，辐射前后外周血白细胞变化较大，说明辐射损伤模型已建立，组内数据满足统计学正态分布。药物组，与生理盐水组比较，B、D、F三组均在辐射后对小鼠的外周血白细胞有显著性差异，其中D组在三个阶段均有显著性差异 （与生理盐水组比较，P<0.05），其余各组在统计学上无较大差异。

表2 不同制备方法对辐射前后小鼠外周血白细胞的影响（n=8，±s，109/L）

表2 不同制备方法对辐射前后小鼠外周血白细胞的影响（n=8，±s，109/L）

注：与生理盐水组比较，＊P<0.05，#P<0.01。

编号 剂量（g/kg） 照射前第3天 照射后第3天 照射后第14天A - 16.24±3.42 4.05±0.87 6.09±0.47 B 1.13 17.59±3.03 4.49±1.57 7.12±1.04＊C 2.00 18.55±1.42 5.16±1.14 6.41±2.00 D 3.00 21.63±3.06# 5.18±0.81＊ 7.18±1.09＊E 1.17 19.13±2.96 5.01±1.55 5.96±1.27 F 1.50 20.56±3.58＊ 4.83±0.87 6.98±0.83＊G 3.14 18.24±2.35 4.51±1.21 6.46±0.89 H 1.26 19.08±3.25 5.03±1.06 6.55±1.96

图1 不同制备方法对辐射前后小鼠外周血白细胞的影响

3 讨论

实验选择了干浸膏得率和君药刺五加中紫丁香苷含量［12］作为整方的提取控制指标。不同提取方法研究显示，水煎煮较75%乙醇回流提取干浸膏得率要高，考虑到后续制剂工业化生产，水煎煮提取是更理想的提取方式，此时紫丁香苷的含量为最高，又基于乌梅在煎煮过程中可能会影响复方中的化学成分，最好的提取方法就是刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药水提取干浸膏另加乌梅水提取干浸膏（简称“水3加1”）。从药理作用效果来看，根据外周血白细胞计数结果，“水3加1”组和刺五加、薏苡仁、酸枣仁三味药75%乙醇提取干浸膏另加乌梅75%乙醇提取干浸膏组均能显著增加辐射损伤模型小鼠外周血白细胞的作用，表明其具有一定的抗辐射辅助作用，虽两者之间无统计学差异，但从统计数据来看，“水3加1”组更明显地增加了小鼠辐射后外周血白细胞的作用。因此，“水3加1”是刺薏复方最佳的提取方法以及在该制备下所得的药物具有显著增加小鼠辐射后外周血白细胞的作用。

该课题组前期研究表明薏苡仁中薏苡仁酯对辐射后小鼠外周血白细胞及胸腺脾脏具有一定的保护作用［10］，但由于薏苡仁酯属于脂肪酸类衍生物，不易溶于水和乙醇，故薏苡仁酯的提取采用了超临界二氧化碳萃取法［10］或乙酸乙酯浸提法［13］。在该实验中，研究重点是考察整方在水煎煮和75%乙醇回流提取下，刺薏复方对辐射后小鼠外周血白细胞的影响，为了考虑到薏苡仁酯可能对整方抗辐射产生协同作用，薏苡仁酯另行提取后按处方比加在复方提取物中进行相关实验研究，后续工作还有待进一步进行。

辐射与人们的生活、工作关系越来越密切，如经常接触辐射的工作人员、医疗上接受诊断和放化疗患者、接触矿物质辐射的采矿工人，而现代生活接触最普遍的就是计算机、手机、紫外线等一系列不可避免的辐射，直接或间接伤害人们的身体健康。人们对抗辐射的途径有多种，如穿戴防护衣、出门携带防护伞等，但这些防护措施不仅给人们的生活带来极大不便，而且从根本上消除不了辐射对机体的伤害。目前市场上抗辐射制剂较少，且效果多不尽如人意，而一些抗辐射合成药物在给药的同时也给机体带来了不良反应。中药以其疗效好、不良反应小为特点，制成的制剂在市场上大受青睐，因此对中药抗辐射复方制剂的研发刻不容缓。本实验选用临床抗辐射有效复方，从药物提取方法和抗辐射药理筛选进行研究，该研究主要为刺薏复方及其制剂的开发奠定了基础，为中药抗辐射制剂的应用带来新市场前景。

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［2016－09－13收稿，2016－10－11修回］

［本文编辑：刘一洋］

The effect of different extracts of CiYi Compound on white cell of peripheral blood in radiated injury m ice

WU Ming-jiang①，AO Jing，ZHOU Min，et al.①Department of Pharmacy，Zunyi Academy of Medicine＆Drug，Zunyi，Guizhou 563002，China

ObjectiveTo study the effects of different extracts of CiYi compound on white cell of periphery blood in radiational injury mice.M ethodsThe drugs were extracted with water or 75%ethanol from CiYi compound respectively；the obtained dry extract yield and the content of syringin were used as the index of extraction.The BALB/c mice were exposed to 4GY Co60γ ray at one time on the 14th day after orally administered dry extracts of CiYi Compound and the change of white cells of periphery blood were compared on the third day before radiation，on the third day and 14th day after radiation.ResultsThe dry extract yield and the content of syringin of the water extract were higher than those of the 75%ethanol.The water extract of Wumei was added to other drugs of CiYi Compound could significantly increase white cells of periphery blood in radiational injury mice.ConclusionThe water extract（Wumei alone water added to compoand water）of CiYi Compound can increase white cells of periphery blood in mice after radiation.

CiYi Compound；Extraction；Anti-radiation；White cell of peripheral blood

R931.71

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.04.023

贵州省科技合作计划项目（黔科合LH字［2015］7577号）

563002贵州遵义，遵义医药高等专科学校药学系（伍明江，周敏）；遵义市第一人民医院乳甲科（敖静）；550002贵州贵阳，贵阳中医学院制剂重点实验室（蒋朝晖，吴晓黎）