高尿酸血症对血管钙化作用机制的实验性研究＊

张旭升，黄战军，曾宪钦，朱平先，蔡博治，张勇刚

基础医学

高尿酸血症对血管钙化作用机制的实验性研究＊

张旭升，黄战军＊，曾宪钦，朱平先，蔡博治，张勇刚

目的 观察高尿酸血症对大鼠血管钙化的影响。方法 实验动物（大鼠28只）随机分正常组、高尿酸血症组、钙化组和钙化+高尿酸血症组，每组7只，钙化组采用维生素D3（300 000 U/kg，1次，肌肉注射）和尼古丁（25mg/kg溶于花生油中早、晚各灌胃1次）建立大鼠血管钙化模型，高尿酸组采用2%氧嗪酸钾饲料喂养诱导高尿酸血症模型，分别用苦味酸法和尿酸氧化酶过氧化物酶法检测大鼠血清尿酸和肌酐浓度，用Von Kossa染色检测血管钙化程度，用钙离子测试盒、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒测定大鼠主动脉钙含量和ALP活性，用硝酸还原酶法检测大鼠血浆NO含量。结果 维生素D3和尼古丁能够诱导典型大鼠血管钙化模型，2%氧嗪酸钾饲料喂养可诱导高尿酸血症模型，Von Kossa染色示钙化组主动脉有大量黑色颗粒沉淀，并且血管钙含量、ALP活性明显高于正常组，钙化组+高尿酸血症组钙化最为明显；三组实验组大鼠血浆NO的表达较正常组明显下调。结论 高尿酸血症促进大鼠血管钙化，可能与下调NO的表达和上调ALP活性有关。

高尿酸血症；血管钙化；NO；大鼠

血管钙化是指血管壁钙盐的过量沉积，与生理性骨质形成类似，是主动的、可调节的过程［1］，许多血管活性因子参与血管钙化的过程，但具体机制尚未完全阐明。研究表明，血管钙化是导致临床心血管事件的重要危险因素，常见于冠心病、糖尿病及慢性肾病等，因此，阐明血管钙化机制并为防治血管钙化提供相应的实验依据是目前面临的重要课题之一。高尿酸血症是临床上常见的独立心血管危险因素，研究证明它参与动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生过程，尤其对内皮细胞的损伤［2］，但是否促进血管钙化的发生和发展，目前国内外尚无报道，为此，本研究在动物模型上观察高尿酸血症对大鼠血管钙化的影响，并初步探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品雄性SD大鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，约6～8周龄，160～180 g。维生素D3购自Sigma公司，尼古丁购自Merck公司，纯度>95%；氧嗪酸钾购自开封市行知生物科技有限公司，纯度>95%；2%氧嗪酸钾饲料由北京华阜康生物技术有限公司配制，钙离子测试盒、碱性磷酸酶（alkaline phosphatases，ALP）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；NO试剂盒购自北京华英生物研究所。其余为进口或国产分析纯试剂。

1.2 钙化动物模型制备28只雄性SD大鼠随机分4组，每组7只，分别为正常对照组，钙化组，高尿酸血症组，钙化组+高尿酸血症组。钙化组：第1天早8：00予维生素D3肌肉注射 （300 000U/kg体重），尼古丁灌胃（25mg/kg，溶于花生油），晚18：00尼古丁重复灌胃一次。正常对照组：大鼠予等量生理盐水肌肉注射和单纯花生油灌胃。 高尿酸组：采用2%氧嗪酸钾饲料喂养诱导高尿酸血症模型。钙化组+高尿酸血症组：在钙化组基础上加用2%氧嗪酸钾饲料喂养。4 w后称重，3%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取血处死，将血置入含有EDTA和抑肽酶的试管中，4℃离心分离血浆，-80℃保存。摘取主动脉组织，用冰生理盐水冲洗后，切取部分主动脉组织，石蜡包埋，染色，其余组织-80℃储存待测。

1.3 Von Kossa染色取石蜡包埋的大鼠胸主动脉段，制作4μm切片，常规脱蜡、脱水。浸入1%硝酸银溶液，在紫外线下照射30min后，将切片浸入5%硫代硫酸钠溶液中1min，最后用0.25%碱性品红返染。经脱水、透明、封片后，光镜下观察血管钙盐的沉积。

1.4 血管组织ALP活性及钙含量测定将大鼠主动脉组织约50mg，匀浆后，4℃离心，先取上清以考马斯亮蓝法行蛋白定量，再分别按照ALP测定试剂盒（磷酸苯二钠法）及钙测试盒（甲基百里香酚蓝比色法）说明书测定匀浆液ALP活性及钙含量。

1.5 血浆NO含量的测定取血浆约200μl，采用硝酸还原酶法测定血浆NO含量，具体步骤按NO试剂盒说明书操作。

1.6 血清尿酸和肌酐的测定取血清约200μl，送汕头大学医学院第一附属医院检验科，分别用苦味酸法和尿酸氧化酶过氧化物酶法检测大鼠血清尿酸和肌酐浓度。

1.7 统计学方法采用Graph Pad Prism 4统计数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血管钙化的特征用Von Kossa染色可观察到钙化组和钙化+高尿酸血症组主动脉中膜弹性纤维间黑色颗粒沉积，表明钙盐沉积，钙化+高尿酸血症组钙盐沉积尤为明显，而正常组和单纯高尿酸血症组均未见钙盐沉积。见图1。

图1 大鼠主动脉Von Kossa染色，黑色颗粒为钙盐沉积（×100）

2.2 大鼠主动脉组织钙含量及碱性磷酸酶活性变化钙化组和钙化+高尿酸血症组血管钙含量及碱性磷酸酶活性明显高于正常组和单纯高尿酸血症组（P<0.01），以钙化+高尿酸血症组最为明显。见表1。

表1 主动脉钙含量与血管ALP活性比较（±s）

表1 主动脉钙含量与血管ALP活性比较（±s）

注：与正常组比较，＊P<0.01；与高尿酸血症组比较，#P<0.01。

血管ALP（U/g蛋白）正常组 7 0.46±0.15 109.80±16.50钙化组 7 0.88±0.06＊ 196.00±16.43＊#高尿酸血症组 7 0.47±0.15 105.90±18.19钙化+高尿酸血症组 7 1.08±0.08＊ 262.80±65.15＊#组别 n 血管钙含量（mmol/g蛋白）

2.3 大鼠血清尿酸、肌酐及血浆NO浓度的变化见表2。

表2 血清尿酸、肌酐和血浆NO浓度的变化（±s）

表2 血清尿酸、肌酐和血浆NO浓度的变化（±s）

注：与正常组比较，＊P<0.01；△P<0.05；与钙化组比较，#P<0.01。

NO（μmol/L）正常组 7 22.29±9.71 28.57±5.77 68.96±3.35钙化组 7 21.57±7.21＊43.57±10.44＊63.60±5.29高尿酸血症组 7 75.00±10.07 36.43±4.28△ 49.39±1.16＊#钙化+高尿酸血症组 7 121.90±21.51＊59.00±14.92＊48.03±2.22＊#组别 n 尿酸（μmol/L）肌酐（μmol/L）

3 讨论

许多研究表明，血管钙化与生理性骨质形成类似，是主动的、可调节的过程，与骨组织的骨化过程相似，包括基质小泡的出现、细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性的增加，其中最重要的特征是血管平滑肌细胞由收缩型表型转变为成骨细胞表型，并分泌多种骨相关蛋白和活性因子，使血管发生钙化。在病理情况下如氧化应激及炎症反应等，可导致血管损伤，激活多条信号通道包括TGF-β/BMPs/Smad通路和MAPK通路等［3，4］，促进血管钙化的发生和发展。因此，血管钙化的调节受促进血管钙化因子与抑制血管钙化因子的相互作用影响。本课题组前期研究发现salusinβ、醛固酮和部分炎症因子等活性因子的表达均与血管钙化的程度呈正相关［5-7］，提示其有促进血管钙化的作用。促进血管钙化因子之间对血管钙化的发展有协同作用，并可通过下调抑制血管钙化因子如intermedin［8］而削弱其保护血管功能的作用，从而加速血管钙化的进展。大量前瞻性流行病调查研究表明，高尿酸血症不仅是痛风的重要原因，而且是许多心血管疾病的独立危险因子［9］。高尿酸血症可以损伤血管并促进动脉粥样硬化，是否促进血管钙化尚不清楚。

实验结果表明大剂量维生素D3合用尼古丁可造成主动脉中膜钙盐沉积，并且主动脉组织钙含量增加，ALP活性上调，提示典型血管钙化模型成功建立。采用2%氧嗪酸钾饲料喂养四周亦可建立稳定的高尿酸血症动物模型。钙化组和钙化组+高尿酸血症组血管钙含量、ALP活性明显高于正常组和单纯高尿酸血症组，且钙化组+高尿酸血症组钙化最为明显，而单纯高尿酸血症组未显示血管钙化倾向，提示高尿酸血症不是血管钙化的始动因子，而是促进血管钙化因子。

多项研究表明，尿酸与血管损伤尤其在动脉粥样硬化关系密切，可能机制与尿酸损伤血管内皮细胞并使NO合成减少［2，10］和促进血管平滑肌细胞增殖和迁移等相关［11］。而NO是在NO合成酶作用下，催化左旋精氨酸转变成L-瓜氨酸而生成，血浆NO主要由血管内皮细胞合成分泌，是反映血管内皮功能的主要指标之一。三组实验组大鼠血浆NO的表达较正常组明显减少，高尿酸血症组和钙化+高尿酸血症组钙化最为明显，且两组之间无统计学差异，而钙化组血清尿酸轻度减少，但与正常组无统计学差异，说明高尿酸血症可损伤血管内皮功能，从而使内皮细胞分泌NO减少，而单纯血管钙化未能明显影响内皮功能，提示尿酸促进血管钙化的可能机制与其损伤血管内皮功能相关。同时发现高尿酸血症和钙化大鼠肾功能轻度异常，与本课题组前期研究和其他相关研究结果相符［12，13］，且钙化+高尿酸血症组肾功能异常最为明显，可能机制与尿酸、血管钙化协同损伤肾微血管有关，而肾功能不全亦有可能加重血管钙化的进展。

该实验发现高尿酸血症是一个新的促进血管钙化的因子，可能机制与尿酸损伤血管内皮功能使NO表达减少、上调ALP活性及损伤肾功能等相关，确切分子学机制和可能涉及的信号通路仍需进一步研究，但仍能为临床防治血管钙化提供一种新的策略与靶点。

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［2016－09－12收稿，2016－10－10修回］

［本文编辑：韩仲琪］

Effect and mechanism of hyperuricem ia on vascular calcification in model of rats

ZHANG Xü-sheng①，HUANG Zhan-jun，ZENG Xian-qin，et al.①Department of Cardiology，Longgang District's People's Hospital of Shenzhen，Shenzhen，Guangdong 518172，China

ObjectiveTo observe the effect of hyperuricemia in vascular calcification model of rats.M ethodsRats（n=28） were random ly divided into normal，hyperuricemia，calcification and calcification plus hyperuricemia groups（n=7，for each group）.Calcification group was induced by a single dose intramuscular injection of vitamin D3（300 000U/kg）plus nicotine（25mg/kg dissolved in peanut oil）gavage in the morning and evening.Hyperuricemia group was induced by 2%oteracil potassium feed.The concentration of uric acid and creatinine in serum were detected by picric acid method and uric acid enzyme peroxidase respectively.Vascular calcification was determined by Von Kossa staining，calcium content and alkaline phosphatase（ALP）activity were detected by using calcium assay kit and alkaline phosphatase detection kit respectively，and NO content in the plasma was detected by nitrate reductase assay.ResultsTypical vascular calcification model of rats were induced by vitamin D3and nicotine，and the hyperuricemia model of rats were induced by 2%oxygen potassium feed too. Von Kossa staining showed that mass black granule deposited in aorta of calcification model of rats，calcium content and alkaline phosphatase（ALP）activity in calcified group were increased significantly than those in the normal group，and the degree of calcification in calcification plus hyperuricemia groups was the most obvious.and the expression of NO in plasma of the three groups was down-regulated significantly compared with those in the normal group.ConclusionHyperuricemia promotes vascular calcification in rats，which may be related to the down-regulation of NO expression and up-regulation of ALP activity.

Hyperuricemia；Vascular calcification；NO；Rat

R543

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.04.022

深圳市龙岗区创新科研基金资助项目（YLW20150514 114556218）

518172广东深圳，深圳市龙岗区人民医院心血管内科（张旭升，黄战军，曾宪钦，朱平先）；515041广东汕头，汕头大学医学院第一附属医院分子心脏病学实验室 （蔡博治）；515021广东汕头，汕头大学医学院第二附属医院心内科（张勇刚）

黄战军，Email：CharlesHZJ@163.com