海洋放线菌A3202在不同培养基中的培养特征比较

2017-04-18鹿连明杜丹超胡秀荣蒲占湑黄振东张利平陈国庆

浙江农业科学 2017年3期

关键词：高氏放线菌琼脂

鹿连明，杜丹超，胡秀荣，蒲占湑，黄振东，张利平，陈国庆

(浙江省农业科学院浙江省柑橘研究所，浙江台州 318020)

海洋放线菌A3202在不同培养基中的培养特征比较

鹿连明，杜丹超，胡秀荣，蒲占湑，黄振东，张利平，陈国庆*

(浙江省农业科学院浙江省柑橘研究所，浙江台州 318020)

为明确海洋放线菌A3202发酵培养所需的最佳条件，促进对其活性代谢产物抑菌活性研究的深入开展，测定了菌株A3202在不同固体和液体培养基中的形态特征。结果表明：菌株A3202在不同琼脂含量高氏1号培养基上的培养特征存在明显差异，琼脂含量2.0%以下的培养基不利于菌株A3202的气生菌丝生长及孢子形成；该菌株在相同配方但不同黄豆粉来源的黄豆粉培养基上的形态特征也表现出明显差异，现磨生黄豆粉制备的培养基更利于菌株菌丝生长和产孢。

海洋放线菌；培养基；培养特征；黄豆粉

海洋微生物由于长期在高盐、高压、低温、无光照的海洋环境中生长繁殖，通常具有独特的代谢途径和遗传背景，形成了与陆生微生物不同的生理性状和特征，使其具备了产生结构新颖、功能特殊的活性物质的能力[1]。目前，普遍认为海洋微生物及其活性物质是新型医药研发的重要资源[2]。而在利用海洋微生物防治植物病害方面，目前虽然相关的研究报道较少，但却显示出了良好的开发利用潜力。

近年来，本课题组从海洋生物中分离了多种对植物病原菌具抑菌活性的放线菌。其中，菌株A3202对柑橘青霉病菌(Penicilliumitalicum)、柑橘绿霉病菌(P.digitatum)和柑橘炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等多种植物病原菌具有较强的抑菌活性，表现出较好的开发利用前景。为此，本研究测定了该菌株在不同固体和液体培养基中的形态特征，以期明确发酵培养所需的最佳条件，为今后对其开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

海洋放线菌A3202为本课题组从海洋生物鳞笠藤壶(Tetraclitasquamosa)中分离获得，其对柑橘青霉病菌、绿霉病菌和炭疽病菌等多种植物病原菌均具较强的抑菌活性，初步鉴定该菌株为米修链霉菌(Streptomycesmisionensis)[3]，接种于高氏1号斜面培养基培养后，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 供试培养基

高氏合成1号液体培养基购自杭州百思生物技术有限公司，配方为：可溶性淀粉2.0%、硝酸钾0.1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.05%、硫酸亚铁0.001%，向其中添加不同量的琼脂至终浓度分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%。加入蒸馏水煮沸溶解，分装至三角瓶中，于121 ℃高压灭菌20 min后备用。

液体发酵用培养基为黄豆粉培养基，配制方法为：称取20 g黄豆粉，加入到1 000 mL蒸馏水中煮沸30 min，4层纱布过滤后取滤液，加入葡萄糖20 g、硫酸铵5 g、氯化钠8 g和碳酸钙2 g，加热溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，分装至三角瓶中，于121 ℃高压灭菌20 min后备用。所用黄豆粉分别为购自天津利发隆化工科技有限公司的发酵用黄豆粉，购自淘宝网上农家磨制的黄豆粉，以及利用多功能粉碎机研磨生大豆所得的黄豆粉。

1.3 菌株活化

取4 ℃冰箱保存的菌株A3202，在超净工作台中用无菌接种环刮取培养基表面菌丝，于新鲜制备的高氏1号培养基中划线，然后置于28 ℃恒温培养箱中培养至菌丝长出，作为下一步试验用菌种。

1.4 菌株接种

用无菌接种环刮取上述培养活化的菌株A3202的菌丝，在含1.0%～3.5%琼脂的高氏1号培养基平板上划线，然后置于28 ℃恒温培养箱中培养。用无菌打孔器在上述高氏1号培养基上打取直径5 mm的菌饼，将其接种至黄豆粉液体培养基中，置于28 ℃恒温摇床， 180 r·min-1振荡培养。

1.5 培养特征观察

在不同培养时间，肉眼直接观察并记录不同琼脂含量高氏1号培养基上菌株A3202的培养特征。用移液枪吸取20 μL各黄豆粉培养基中菌株A3202的培养液，滴加到载玻片上，置于光学显微镜下观察培养产物的形态特征并拍照。比较不同琼脂含量高氏1号培养基及各黄豆粉液体培养基中菌株的培养特征。

2 结果与分析

2.1 菌株A3202在高氏1号培养基上的培养特征

在28 ℃恒温培养箱中培养第3、6、10和24天，观察并记录菌株A3202的培养特征，结果见表1，菌株A3202在不同琼脂含量高氏1号培养基上的培养特征如图1所示。菌株A3202在不同琼脂含量高氏1号培养基上的培养特征存在明显差异，琼脂含量2.0%以下的培养基不利于菌株A3202气生菌丝生长及孢子的形成，而在琼脂含量2.0%及以上的培养基上，菌株A3202生长速度较快，气生菌丝致密发达，且易于产生大量孢子。

表1 菌株A3202在不同琼脂含量高氏1号培养基上的形态特征

A～E为琼脂含量分别为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%

2.2 菌株A3202在不同黄豆粉培养基上的培养特征

28 ℃恒温摇床180 r·min-1振荡培养第3、7、14 d，在光学显微镜下观察各培养产物的形态特征，结果见表2，菌株A3202在各黄豆粉培养基中的形态特征如图2所示。可以看出，菌株A3202在相同配方但不同黄豆粉来源的培养基中形态特征表现出明显差异。在生黄豆现磨成粉的培养基培养一定时间后，菌株A3202可产生大量的菌丝和孢子，而在购买的黄豆粉成品制备的培养基培养14 d后，菌株A3202只产生大量孢子，难以观察到菌丝。

表2 菌株A3202在不同黄豆粉培养基上的形态特征

注：培养基A的黄豆粉为天津利发隆化工科技有限公司的发酵用黄豆粉，培养基B的黄豆粉为淘宝网上农家磨制的黄豆粉，培养基C的黄豆粉为生大豆现行研磨的黄豆粉。

A，菌株A3202的椭圆形孢子；B，菌株A3202的孢子变为长条形；C，菌株A3202的菌丝图2 菌株A3202在黄豆粉培养基中培养后的不同形态特征

3 小结与讨论

菌株A3202为本课题组从海洋生物鳞笠藤壶中分离获得的放线菌，其对柑橘青霉病菌、绿霉病菌和炭疽病菌等多种植物病原菌均具较强的抑菌活性。为进一步探索该菌株对植物病害的生防潜能，我们对其发酵工艺进行了优化。在试验过程中发现，菌株A3202在不同批次高氏1号培养基中培养特征存在明显差异，有时难以培养获得气生菌丝发达的菌落，影响了菌株的保藏及扩大培养。为分析产生该问题的原因及查找解决办法，以保障今后对菌株A3202开发利用的顺利进行，特开展了本研究。结果发现，高氏1号培养基中琼脂含量的高低与菌株A3202气生菌丝的生长情况具有明显相关性，相对高琼脂浓度的高氏1号培养基利于菌株A3202气生菌丝的生长及产孢，分析认为菌株A3202在相对干燥的环境中更易于生长产孢。菌株A3202在不同黄豆粉制备的黄豆粉培养基中形态特征表现出明显差异，在现磨生黄豆粉制备的培养基中生长良好，可产生大量菌丝和孢子，而在其他2种黄豆粉成品制成的培养基中只产生孢子，无菌丝形成。推测可能是现磨的生黄豆粉较黄豆粉成品能提供更多的营养，从而利于菌株A3202孢子的萌发、菌丝的生长及产孢。

在利用海洋微生物防治植物病害方面，人们已开展了诸多有益的探索。如聂亚锋等[4]从海水中分离的海洋细菌PY- sw- 1对白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)等多种病原菌表现出较强的抑制活性；何红等[5]从海洋红树内分离的海洋细菌CⅢ- 1除对辣椒青枯病有良好的防效外，还能明显促进辣椒的生长；邵彦坡等[6]从浅海海域中分离的放线菌菌株B5的发酵液对西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)等13种植物病原真菌的菌丝生长抑制率均在80%以上，且具有较好的传代稳定性、热稳定性和酸稳定性。本课题组已有研究表明，放线菌A3202在植物病害防治方面具有良好的开发应用前景，为此，在优化该菌株发酵工艺的基础上，将进一步探索其对植物病害的生防潜能，为今后开发相关生防菌制剂提供依据。

[1] 尚卓, 王斌贵. 海洋真菌来源的抗菌活性物质研究:方法与进展[J]. 生命科学, 2012, 24(9): 997- 1011.

[2] 刘全永, 胡江春, 薛德林, 等. 海洋微生物生物活性物质研究[J]. 应用生态学报, 2002, 13(7): 901- 905.

[3] 鹿连明, 杜丹超, 程保平, 等. 海洋放线菌A3202的分离鉴定及其对柑橘采后病害的防效[J]. 植物保护学报, 2014,41(3):327- 334.

[4] 聂亚锋, 刘永锋, 李德全, 等. 海洋细菌PY- sw- 1产生的抗菌物质及其抑菌活性[J]. 植物保护学报, 2008, 35(4): 373- 374.

[5] 何红, 欧雄常, 王立才, 等. 红树内生海洋细菌CⅢ- 1菌株对辣椒青枯病的防病效果[J]. 植物保护学报, 2008, 35(6): 497- 500.

[6] 邵彦坡, 方丽萍, 魏少鹏,等. 海洋放线菌B5菌株发酵液抗菌谱及稳定性研究[J]. 西北农业学报, 2007, 16(3):248- 251, 256.

(责任编辑：侯春晓)

2016- 09- 26

台州市科技计划项目(131ky20)

鹿连明(1979—)，男，山东安丘人，博士，副研究员，研究方向为柑橘病虫害，E- mail: minglu79@126.com。

陈国庆(1964—)，男，浙江诸暨人，本科，研究员，研究方向为柑橘病虫害，E- mail: cgq5373@163.com。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170326