金线蛙不同时期蝌蚪骨骼的双染色研究

2017-04-17陈亚菲张雅楠王洪凯王明山

山东畜牧兽医 2017年3期

关键词：趾骨染液金线

陈亚菲高鑫张雅楠王洪凯王明山

（枣庄学院山东枣庄 277160）

金线蛙不同时期蝌蚪骨骼的双染色研究

陈亚菲高鑫张雅楠王洪凯王明山*

（枣庄学院山东枣庄 277160）

本文对金线蛙不同发育时期蝌蚪的后肢骨进行双重染色，研究其骨骼的发育。结果显示，金线蛙后肢骨的发育模式基本遵循着由近端到远端发育的顺序，体现了金线蛙由水栖到陆栖环境转换的骨骼系统形态改变和生态适应。

金线蛙蝌蚪骨骼双染色法

金线蛙(Rana plancyi plancyi)在我国分布广、数量较多，是害虫的天敌。两栖动物代表着脊椎动物发育的原始模型，蛙的发育机制与人类等高等动物极为相似，从两栖动物还可以演绎出爬行动物、鸟类和哺乳动物的不断改善的发育进程。金线蛙是典型变态发育的两栖动物，其体发育过程经历了卵、蝌蚪、幼蟾蜍、成蟾蜍四个阶段。在从受精卵发育到成蟾蜍的变态过程中会进行骨骼的重构和四肢的发育，进而成为适应陆生环境的四足两栖类。对两栖动物肢体不同部位的发育模式及骨化次序进行观察并研究，并需要掌握好骨骼双染色法制作标本，为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

金线蛙卵采自鲁南地区的山东省枣庄市市中区枣庄学院周围的小水潭(E116°48′-117°49′，N34°27′-35°19′，海拔191m。蛙卵置于透明玻璃缸内，放于向阳处进行驯养，在蝌蚪培育期间(60～90日龄)，每天对蝌蚪进行采样，每次随机采集10尾，用显微镜或解剖镜测定全长后立即用5%的福尔马林溶液进行固定，供日后透明标本制作。

1.2 染色液的配置

1.2.1 茜素红染色液配制按100ml的0.3mol/L的氢氧化钾溶液加入5mg的茜素红的比例配置成红色的硬骨染液。

1.2.2 阿利新蓝染液取20mg阿利新蓝染料，加人60ml无水乙醇，再加40mI冰乙酸（pH≤1.0）。

1.2.3 脱色液梯度酒精(25%、50%、75%、100%)。

1.2.4 透明液的配制（1）透明液一：丙三醇20ml、蒸馏水77ml、2%氢氧化钠溶液3ml混合而成。（2）透明液二：丙三醇75ml、蒸馏水25ml。（3）透明液三：100%的丙三醇100ml。

1.2.5 胰酶溶液 30ml饱和硼酸溶液+70ml蒸馏水+胰蛋白酶1g。

1.3 染色处理步骤

1.3.1 软骨染色首先将用福尔马林固定的蝌蚪用蒸馏水滴洗数次直到软化为止，直接放置于阿利新蓝染液中浸泡处理5d，染色时间视软骨染色程度而定，直至后肢骨骼出现浓青色为止。

1.3.2 脱色将标本从软骨染色液中取出，放入脱色液中脱色，接着用95%乙醇水溶液浸泡2h两次，然后再依次分别用25%、50%、75%、100%的乙醇水溶液各处理2h，最后将标本移入蒸馏水中放置24h直到标本沉下。

1.3.3 去组织处理经蒸馏水浸泡后的标本用胰酶溶液36℃条件下进行去组织处理，每隔2d溶液呈蓝色时，及时更换酶溶液，反复多次直至蝌蚪骨骼清晰可见。

1.3.4 硬骨染色将经酶溶液处理后的标本放入茜红素染液，染色3～5h，直至硬骨染红为止

1.3.5 褪色和透明然后将茜红素染液换成0.5%的NaOH溶液，浸泡数小时，直至多余染色液完全去除。

1.3.6 脱水和固定再依次转换成透明液一、透明液二和透明液三溶液，各处理5h。

1.3.7 观察使用配备有数码照相机的生物显微镜和解剖镜观察各日龄蝌蚪骨骼发育形态特征，并进行拍照[1,4]。

2 结果

（1）双染成功的标本，已骨化的骨骼被茜素红染成红色或紫红色，软骨则被阿利新蓝染成蓝色，在红色的骨周围或两端都是染成蓝色的软骨，界限明显，骨骼完好无损。双染的标本在显微镜下可清楚地观察到骨骼的发育形态。（2）金线蛙蝌蚪的后肢(hind limb)是由股骨(femur)、胫腓骨(tibio-ibula)、跗骨 (tarsus)、蹠骨(metatarsus)、趾骨(phalanges)。（3）股骨为股部的一根棒状硬骨，其近端呈圆球状，与髂臼连接，称股骨头，股骨头嵌入髋臼构成髋关节，远端与胫腓骨相关节。股骨的长度随时间的增长有所增加，软骨性股骨的骨干逐渐骨化，股骨骨干的骨化由中央的骨干向两端逐渐延伸。到图三时期，股骨的骨干已完全骨化，但两端骨骺仍未骨化[5]。（4）胫腓骨为胫部的一根长骨，骨干内外两面中间各有一条浅纵沟，表明此骨系由胫、腓两骨合并而成，其近端与股骨形成膝关节，远端与跗骨相关节。稍长于股骨。（5）跗骨(2-I)5枚，排成2列。与胫腓骨相关节的是一堆短棒状骨，外侧的为腓跗骨(跟骨)，内侧的称胫跗骨(距骨)，两骨上端愈合，下端相互靠拢。另3枚呈颗粒状，在跟骨、距骨和跖骨之间排成一横列。（6）蹠骨(2-II)为5支细长骨节，第4支最长，第3支和第5支次之，第2支又次之，第1支最短。（7）趾骨(2-III)是与蹠骨相连的骨节，趾节向远端逐渐细小，每个队、趾各关节两端都覆以软骨髓。后肢五趾，第1、2趾有2枚趾骨，第3、5趾有3枚趾骨，第4趾有4枚趾骨[6]。

1.Cosner39期，附骨出现，而且胫骨和膝骨两端逐渐有愈合现象; 2.Cosner40期，趾骨以3-4-3-2-2的排列模式出现，而且可观察到前拇趾的第二趾骨; 3.Cosner43期，趾骨已完全骨化，但前拇趾及远端趾骨仍未骨化

3 讨论

金线蛙后肢骨的发育模式基本遵循着由近端到远端发育的顺序。变态过程中后肢股骨与胫腓骨相对长度的变化趋势是幼蛙登陆的重要指标。两栖类蝌蚪的形态在多样性的变态过程中，后肢胫腓骨的愈合体现了无尾类骨骼发育的保守性，以及由水栖到陆栖环境转换的骨骼系统形态改变和生态适应。两栖动物变态过程中骨骼的骨化增加了骨密度，导致支撑能力增强，也进一步解决了无尾目动物由水生到陆栖身体重量担负问题。

3.1 染液的配制和保存

用蒸馏水配制茜素红饱和液(即原液)时并不需要精确称量，配制好后转入棕色试剂瓶中避光保存。茜素红染液、阿利新蓝染液均要求常温避光保存，否则会致标本着色过浅或无法着色。

3.2 染色和透明处理

在进行软骨染色时，要在强阳光下进行，如果遇到阴天，则需要借助紫外光的照射。用透明液进行透明时，时间不要过长，应定时观察标本情况，时间过长会导致骨骼过软而散掉。

3.3 染色后标本的保存

为便于对染色后标本骨骼的观察，可用宽底的玻璃称量瓶(40mm×40mm)装标本，这样既便于观察，同时能防止染液被蒸发，但应注意在一个容器内不要放置过多的标本，最好是每瓶1～2个，因为标本过多，过于拥挤会延长染色时间。对于已有部分损伤的标本，如尾部断开、四肢与躯干分开的标本，则每个瓶只装一个。没有经过脱水处理的标本，容易发生霉变，从而影响观察。因此，双染成功的标本经过逐级梯度甘油进行透明和脱水后，加入100%甘油保存，同时加少许麝香草酚以防腐。总之，骨骼双染标本的制作，为动物学的骨骼研究、比较解剖学的研究和实验教学提供了直观、真实的形态学素材，在实验教学中能激发学生的学习兴趣，使学生对动物骨骼的发育过程和各骨的位置关系有更直观的认识，同时骨骼双染的标本可以长期保存作为陈列和展览所用。

[1] 刘万胜, 黄明辉, 刘力华等. .青蛙骨骼染色透明标本的制作及应用[J]. 现代预防医学, 2008, 39(9)∶ 1700-1701.

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[4] 王秋荣, 倪明莹, 林利民等. 大黄鱼仔稚鱼脊柱、胸鳍及尾鳍骨骼系统的发育观察[J]. 水生生物学报, 2010, 34(3)∶ 467-469.

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