禽致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性研究

王传春 袁东方 孙秋艳 李 舫

（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

禽致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性研究

王传春 袁东方 孙秋艳 李 舫*

（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌所引起的严重危害养禽业健康发展的重要细菌性传染病之一。本试验对寿光市某养殖场送检的具有典型大肠杆菌病的临床症状的15只病死鸡进行剖检，病理组织学观察，分离鉴定出禽致病性大肠杆菌；并用分离纯化的细菌对7日龄的雏鸡进行注射，连续观察7d，研究其致病性及感染雏鸡发病特点，同时对死亡雏鸡进行了系统的病理组织学观察，分析了大肠杆菌感染雏鸡的致病规律。为临床上雏鸡大肠杆菌病的诊断和防治提供理论依据。

禽致病性大肠杆菌 分离鉴定 致病性

日龄的肉鸡发病流行最严重，主要经鸡的呼吸道、消化道和种蛋等途径进行传播[5]。为了解APEC的致病性及感染雏鸡的发病特点，本研究对潍坊市寿光市某养殖场送检的具有典型大肠杆菌病的临床症状的15只病、死鸡进行剖检，病理组织学观察，分离鉴定，并对7日龄的雏鸡进行攻毒试验，对实验结果进行分析，为临床上雏鸡大肠杆菌病的诊断和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 潍坊市寿光市某养殖场送检的15只病、死鸡。

1.2 试剂 营养肉汤培养基、MAC(麦康凯)培养基、

PC(普通营养琼脂)培养基、EMB(伊红美蓝)培养基、SS琼脂培养基均购自于北京陆桥技术股份有限公司。

1.3 试验动物 购自山东某种禽孵化场的7日龄的雏鸡30羽份。

1.4 病理剖检及样本采集 对送检的15只病死雏鸡进行剖检，详细记录各个器官的病理变化，无菌采集病死鸡的心、肝、脾、肺、肾等组织，一部分用于细菌分离培养，一部分用4%多聚甲醛固定48 h用于切片制作。

1.5 细菌的分离培养 以上病料在MAC上接种划线，37℃恒温箱培养18h。观察菌落形态并选取单个粉红色典型菌落接种于PC上进行扩大培养。取扩大培养的菌落接种于EMB、SS培养基再次培养并鉴别；取典型菌落置于肉汤之中在37 18h℃ 的条件下纯培养，用少量石炭酸生理盐水洗去菌苔、稀释制成菌悬液(细菌约1×109个/ml)，储存备用。

1.6 细菌的实验室鉴定 （1）镜检：于显微镜下观察细菌的染色情况与形态。（2）生化试验：将分离的菌株接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐等微量糖发酵管，37℃恒温培养18～24h，观察结果。

1.7 禽大肠杆菌致病性的研究 30羽试验雏鸡随机分试验组(A组)、对照组(B组)两组，取上述储备菌液(1×109个/ml)分别接种A组15羽七日龄雏鸡，每只雏鸡于颈部采取皮下注射3ml菌液。B组雏鸡分别在相同部位皮下接种3ml灭菌生理盐水。记录两组雏鸡初始体重，然后将其置于33℃左右灯光取暖的温室中，按照(8g/只)集中供给全饲料，全天候供水，每天上、下午各一次记录并拾取死亡雏鸡个数，剖检，拍照，采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏用10%福尔马林固定48h以上留做病理切片制作观察，同时每日称量残存雏鸡体重。饲养7d后，将剩余存活雏鸡处死。

2 结果

2.1 临床症状及剖检变化 病鸡表现为精神沉郁、翅膀下垂，呼吸困难等临床症状。剖检病死鸡嗉囊积食，肝肿大，胆囊扩张(图A)，可见胸腔有少量纤维素性渗出物或卵黄样渗出物，卵黄吸收不良(图B)；肝脏淤血，脂肪变性呈土黄色肿大，胆囊扩张(图C)；腺胃浆膜面有点状出血(图D)，肌胃外观没有明显病变。疑似禽致病性大肠杆菌侵袭。

图A：病死鸡嗉囊积食，肝肿大，胆囊扩张

图B：胸腔有少量纤维素性渗出物，卵黄吸收不良

2.2 细菌的培养特性及形态学检查 MAC上18h后呈现红色菌落；PC上圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落；EMB上黑色带金属光泽菌落；SS培养基一般不生长，部分生长者较差，生长者为红色菌落。肉汤均匀混浊，管底有粘性沉淀，液面管壁有菌环。在以上培养基上培养形态与大肠杆菌的形态相一致。革兰氏染色镜检见阴性中等大小、两端钝圆杆状红色细菌。与大肠杆菌形态相符，可确诊此病例主要病因之一为大肠杆菌感染。

图C：肝脏肿大呈土黄色，并见淤血，胆囊扩张

图D：腺胃浆膜面有点状出血点

2.3 生化试验结果 分离菌的生化鉴定结果如表1所示，符合大肠杆菌生化特征，能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇及蔗糖，产酸产气。

表1 分离菌株的生化试验

2.4 致病性实验 禽大肠杆菌致病性实验结果如表2所示。结果所示该大肠杆菌属于高致病毒株，严重影响雏鸡的生长发育以及成活率，对禽类危害极大。

表2 致病性实验结果统计 (只、g)

2.5 雏鸡临床症状及剖检结果

图(E-F)：试验组病雏精神沉郁，羽毛凌乱，双翅下垂，部分雏鸡眼睛紧闭

图(G-H)：试验组雏鸡有典型的气囊炎、肝周炎、心包炎。气囊混浊，心脏被大量纤维素包裹，肝脏表面也覆盖一层黄色纤维素薄膜，可剥离

2.6 雏鸡病理切片

图(I-J)：肾有坏死灶，高倍镜下可见肾小管上皮细胞颗粒变性、空泡变性

图(K-L)：心外膜表面有一层纤维素膜包被，心肌细胞明显变性坏死

图(M-N)：肝脏出现很多坏死灶并出现大量异嗜性颗粒细胞

3 讨论

目前，鸡大肠杆菌病是近年来严重危害养鸡业的主要疾病之一，大肠杆菌能感染各种年龄的家禽，但多发生于幼龄家禽，特别是雏鸡的发病率和病死率均较高，本研究通过临床诊断、细菌分离培养、染色镜检、生化试验等对潍坊市寿光市某鸡场送检的15只疑似大肠杆菌病感染的病死鸡的病因进行了系统地实验室检测分析，初步判定为大肠杆菌感染致死，同时对分离纯化的细菌进行了雏鸡接种攻毒实验，结果表明分离菌株具有高致病性，感染雏鸡后很快表现出临床症状，剖检病变典型，病理组织学检查表明各组织器官均有变性坏死、炎性细胞浸润病变，该项研究不仅为禽大肠杆菌病进一步提供了临床病理学资料，而且为临床上雏鸡等多种动物的大肠杆菌病的诊断和防治提供理论依据，对雏鸡的健康养殖具有重要的指导意义。

[1] 马兴树, 范翠蝶, 夏玉龙. 禽致病性大肠杆菌研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2013, 02∶ 169-174.

[2] 贾雪波, 盛中伟, 肖芹等. 山东、安徽部分地区2016年禽致病性大肠杆菌的分子流行病学调查[J]. 中国家禽, 2016, 36(19)∶ 71-74.

[3] DOU X H,GONG J, HAN X G, et al. Characterization of avian pathogenic Escherichia coli isolated in eastern China[J]. Gene, 2015(10)∶ 12.

[4] 白灏, 冀辉, 韩先干等. 禽致病性大肠杆菌江苏、安徽分离株的生物学特性分析[J]. 微生物学通报, 2013, 40(7)∶ 1315-1322.

[5] 胡林, 刘晓燕, 王颢锦等. 华东部分地区禽致病性大肠杆菌系统进化分群及毒力相关基因的检测[J]. 畜牧与兽医, 2014, 46(1)∶ 9-14.

S853.61+2

A

1007-1733(2017)03-0008-02禽致病性大肠杆菌(Avain Pathogenic Escherichia. coli，APEC)是引起鸡、火鸡及其他禽类局部或全身性大肠杆菌病的病原，是严重危害养禽业健康发展的重要细菌性传染病之一[1]。近年来，随着养禽业向集约化、规模化方向发展，禽大肠杆菌病经常发生，对养禽业造成重大的经济损失[2-4]。不同品种、不同日龄的鸡一年四季均能感染此病，但以冬末春初和霉雨季节最为常见，20～45

2016-11-21）

山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目(SDAIT-13-011-05)；山东省潍坊市科学技术发展计划(2015GX042)。

*通讯作者