ALV-J p19蛋白细胞毒性的研究

代灿灿 孙香丰

（青岛市动物园 山东 青岛 266000）

ALV-J p19蛋白细胞毒性的研究

代灿灿 孙香丰

（青岛市动物园 山东 青岛 266000）

禽白血病(Avian Ieukosis)是一类由禽白血病病毒引起禽类以多肿瘤性疾病为主要特征的统称[1]。禽白血病(J亚群)对我国肉鸡养殖业造成了严重危害，但目前对该病毒致病的分子作用机制尚未明确。本实验中，通过AH109酿酒酵母表达融合蛋白来观察酵母细胞生长情况，进而分析ALV-J的p19蛋白是否具有细胞毒性。结果表明，重组酵母在生长曲线和斑点试验中表现出明显的生长抑制，p19蛋白具有细胞毒性。

20世纪90年以后，禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在在我国肉鸡养殖业泛滥开来，造成巨大经济损失。因该病毒突变率高，防治困难。目前尚无有效疫苗，严重制约了禽养殖业的发展[2，3]。

1 ALV的分子生物学特征

ALV属于反转录科反转录属的单股正链线性RNA病毒，基因组全长7.2kb～7.8kb间。病毒粒子近似球形，呈正20面体对称。病毒囊膜是脂质双层结构，镶嵌着env基因编码的gp37跨膜蛋白和gp85表面蛋白[3,4]。本文研究的P19蛋白为ALV gag基因编码的基质蛋白，位于病毒表面且序列高度保守，与病毒囊膜蛋白相连，具有亲脂作用，是具有病毒亚群特异性位点的多肽[5]。

2 P19-pGBKT7重组质粒的构建和表达

将p19蛋白的编码基因克隆，5’端引物CCCGGGGAT CCTCTAGAATGGAAGCCGTCA，3’端引物为CTGCA GTTAATAGCAGGATGTGCCAAC。构建于pGBKT7真核表达载体上。经测序和双酶切鉴定后构建正确。

双酶切 Marker pGBKT7 p19-pGBKT7

图1 重组质粒双酶切鉴定图

图2 Western Blot鉴定重组质粒表达

利用LiAc/PEG法将重组质粒做小规模转化入AH109酿酒酵母感受态细胞中。利用SD/-Trp平板上筛选单菌落出现。挑取单克隆置于SD/-Trp液体培养基中，30℃振荡培养至OD600为0.4～0.6。4℃离心后洗涤重悬后，加入Cracking buffer裂解，提取表达蛋白。经Western Blot检测，myc标签融合蛋白得到正确表达。

3 重组菌生长曲线的测定

从已检测表达的重组菌SD/-Trp平板和空载体平板上分别挑取单菌落，对应置于30℃条件下置于SD/-Trp液体培养基中培养。调整起始OD600值相同。然后分时进行OD600的测量，与此同时进行细胞计数，绘制重组菌生长曲线。

图3 OD600吸光度曲线

图4 酵母细胞计数生长曲线

4 重组菌的斑点试验

将转化有空载体和重组质粒的酵母菌株进行斑点试验，将细胞计数后的稀释液依次接种在SD/-Trp固体琼脂平板上，30℃培养1～2d进行观察。

图5 酵母细胞斑点试验

5 讨论

（1）禽白血病是由禽白血病病毒引起的禽类(主要是鸡)良性和恶性肿瘤的一类疾病，它包括淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病、骨髓细胞瘤、血管瘤、内皮瘤、肾真性瘤、纤维肉瘤和骨化石症等。在临床上感染率很高且危害严重，到目前为止，还没有合适的疫苗和有效的药物加以对抗，雏鸡又易出现免疫耐受，对疫苗不产生免疫应答，故只能被动地进行预防[6]。（2）P19是ALV的基质蛋白，目前针对p19的作用机制、p19与宿主间相互作用的研究鲜见报道[6]。本实验中围绕p19蛋白是否具有细胞毒性进行了实验证明。在真核细胞的选择上，酿酒酵母AH109细胞是一种遗传背景清晰的真核表达宿主菌，转化效率高。本实验中通过色氨酸营养缺陷体系来筛选成功转入携带trp1营养筛选标记的酵母细胞。转化有pGBKT7重组质粒的菌株能在此营养缺陷体系中良好生长。（3）在转化方法上，本实验采用了LiAc法(完整细胞转化法)，经LiAc处理的对数生长期的酵母细胞处于感受态，通过热休克处理，在PEG协助下，将质粒DNA转化入酵母细胞，操作较为简单且效率高。（4）酵母细胞生长周期共分为4个阶段，即迟缓期、对数期、平稳期和衰亡期，绘制生长曲线和吸光度曲线呈“S”型。在0～4h内，酵母细胞多处于迟缓期，在4～14h内，酵母细胞多处于平稳期；在14h以后酵母细胞生长进入平稳期。（5）构建了p19-pGBKT7融合表达载体，转化入酵母细胞后成功诱导表达。通过真核细胞常用的吸光度值、细胞计数和斑点试验，检测p19蛋白有无细胞毒性。经检验，发现转入p19-pGBKT7重组质粒的酵母细胞与对照组有明显差异，能够明显抑制酵母细胞的生长，具有细胞毒性。斑点试验作为一种简单经济便捷的观察细胞生长的方法，在固体培养基上发现p19-pGBKT7重组质粒同样抑制生长，表现出较明显的细胞毒性。

综上，通过实验证实，p19蛋白具有较显著的细胞毒性。这一发现为今后探究在ALV感染中p19的作用机理和p19与宿主蛋白相互作用奠定了相应基础。

[1] 于琳琳, 姜艳萍, 王明等.禽白血病病毒J亚群自然感染商品蛋鸡致瘤性新特征[J]. 畜牧兽医学报, 2012, 43(4)∶602-608.

[2] 殷震, 刘景华. 动物病毒学(第2版)[M]. 北京∶ 科学出版社, 1997∶384-397.

[3] 赵振华, 杨钰莹, 成子强. 禽白血病[M]. 北京∶ 中国农业出版社, 2006∶ 16-18.

[4] 郝春丽, 胡梅, 柴建亭. 禽白血病病毒特性的研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2010,1∶20-21.

[5] 杭柏林, 胡建和, 李杰. 关于禽白血病防控的几点建议[J], 现代畜牧兽医, 2015,3∶22-25.

[6] 陈瑞爱, 何芳, 覃健萍等. 禽白血病流行情况及生物防控措施[A].鸡淋巴白血病防控技术研讨会论文集[C]. 2010∶ 261-262.

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1007-1733(2017)03-0070-02

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