禽补体C3d增强新城疫病毒F基因核酸疫苗免疫效果的研究

夏庆祥 沈美艳 李 舫

（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

牛钟相*

（山东农业大学动物医学院 山东 泰安 271018）

王晓艺

（山东省烟台市牟平区姜格庄街道兽医工作站）

禽补体C3d增强新城疫病毒F基因核酸疫苗免疫效果的研究

夏庆祥 沈美艳 李 舫*

（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

牛钟相*

（山东农业大学动物医学院 山东 泰安 271018）

王晓艺

（山东省烟台市牟平区姜格庄街道兽医工作站）

本文对禽C3d的分子结构，对抗原免疫原性的影响做了初步研究。结果表明，理论上本动物C3d的免疫增强效果更好。

C3d F基因 核酸疫苗 免疫原性

补体系统的核心成分是C3蛋白，在补体反应的三条途径中居于枢纽地，是宿主防御机制中的关键分子。C3d是产生于补体激活过程中补体C3裂解后的一个片段。研究发现C3d作为分子佐剂可以降低B细胞的活化阈，促进抗原的加工和递呈，提高抗体水平[1～4]。补体裂解片段C3d由于其分子中的分子内硫酯键和与CD21的结合位点的存在，使其能够发挥分子佐剂的作用从而在抗原诱导的体液免疫应答中发挥重要的调节作用。自 Dempsy等通过基因工程方法将鸡卵溶菌酶(hen egg lysozyme, HEL)分别与小鼠C3d分子串联制备成融合蛋白免疫小鼠从而发现C3d的分子佐剂作用以来，人们陆续克隆了鼠、羊、牛等动物的C3d基因[5～7]，用于基因疫苗的构建或表达融合蛋白，来改进疫苗的免疫原性，以提高疫苗的抗体滴度、亲和力和细胞免疫水平。虽然有报道 C3d能在异源动物中保持免疫佐剂活性，但异源C3d在应用过程中可能产生抗C3d抗体或引起自身免疫从而降低其在疫苗中的免疫佐剂作用，但理论上应用同源C3d可能避免这些缺陷而且可能具有更高的生物学活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 商品绍兴麻鸭，购自山东省枣庄市苗庄种鸭场；AA肉鸡，购自山东省畜禽疾病防治中心。

1.1.2 毒株和菌株：新城疫病毒F48E9株、大肠杆菌(Escherichia, E.coli BL21)，本研究室保存。

1.1.3 试剂和仪器 pMD18-T载体、限制性内切酶、T4DNA连接酶、AMV反转录试剂盒、Taq酶、dNTp等pCR相关试剂，均购自TaKaRa公司；Trizol Reagent，购自Invitrogen公司；凝胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒，购自TIANGEN公司

1.2 方法

1.2.1 C3d的克隆及鉴定 分别取鸡和鸭的肝脏，提取肝脏总RNA，RT-PCR扩增C3d基因，连接到T载体，转化BL21，测序。

1.2.2 P29串联体的构建 参照楮新星[8]等报道的策略，构建pcDNA3.1-P29(2、4、6)串联体，然后将抗原基因连接至pcDNA3.1-P29串联体，构建重组质粒。

1.2.3 重组质粒免疫效果的检测 用试剂盒大量提取重组质粒分别免疫鸡和鸭，做攻毒保护试验。

2 结果

2.1 C3d的克隆及连接

对C3d的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，出现了大小为0.9kb左右的清晰条带，测序后证明得到了C3d基因。

图1 C3d-PMD18-T质粒的酶切鉴定

图2 RT-PCR扩增C3d cDNA

图3 不同动物补体C3d基因进化树

2.2 重组质粒的鉴定

图4 新城疫F基因疫苗酶切鉴定

2.3 血凝抑制试验

血凝抑制是检测新城疫抗体的主要指标之一。在初免后第7、14、21、28天分别采血分离血清，结果取平均值。见图5。

图5 不同F基因疫苗的HI抗体变化

2.4 攻毒保护试验结果

初免后4周每组以F48E9 1000LD50/只攻毒，攻毒后每日观察各组的死亡情况以及健康状况，空载体和空白对照组在3d内全部死亡，其他组有不同程度的死亡和临床症状。攻毒后2周统计各组存活数，结果见附表。

附表 不同F基因疫苗的保护效果比较

3 讨论

国内外对于C3d的研究主要集中在人和小鼠的C3d，试验动物主要是小鼠[8～10]，对鸡、鸭的C3d研究较少。理论上同种动物的C3d比异种动物的C3d具有更高的免疫增强作用，本试验克隆了鸡和鸭的C3d基因，并对其免疫增强作用进行了初步探索。现C3d的免疫佐剂效应主要与CR2/CD21有关[9～11]。C3d可以与B淋巴细胞或者是抗原递呈细胞(APC)上的CD21结合，CD21与CD19一起参与信号传导。其中CD21主要起到桥梁作用，将C3d与B淋巴细胞或者APC连接，CD19主要功能是将抗原信息传递到细胞内部。APC与C3d－抗原复合物结合后，增强了捕获以及加工抗原的能力；B淋巴细胞与C3d－抗原复合物结合后，B细胞表面受体(BCR)与CD19共同传递抗原信息，降低了B淋巴细胞的活化阈，促进B淋巴的分化成熟，增加了抗原特异性B淋巴细胞的数量，从而提高了水平以及抗体维持时间。鉴于CD21的重要作用以及鸡CR2结合区的特殊性，模拟C3d的作用过程，将C3d-P29串联体与F基因通过基因工程的方法相连免疫动物。利用同裂酶BamH I(识别序列为G↓GATCC)和Bgl II(识别序列为A↓GATCT)切割靶序列后可形成相同粘性末端的特性，构建了不同拷贝数的P29基因串联体，作为P29分子佐剂。另据报道，C3d发挥免疫佐剂效应必须要有两个以上的C3d基因串联。因此构建了基因疫苗pCDNA-F-P29.4、pCDNA-FP29.6。免疫动物后发现pCDNA-F-P29.6的HI抗体高出pCDNA-F-P29.4 0.5～2个滴度，连接P29串联体的基因疫苗比单纯的F基因疫苗抗体的出现时间缩短，抗体滴度升高。连接P29串联体的基因疫苗第1周便能够检测到HI抗体，单纯的F基因疫苗直到第3周才能检测到，并且其最高的HI抗体滴度只有2 log2，而pCDNA-F-P29.6的最高滴度达5.7log2。虽然pCDNA-F-P29.6的HI抗体滴度没有灭活苗的滴度高，但是其可以完全抵抗致死量病毒的攻击，这可能与pCDNA-F-P29.6能够诱导更强的细胞免疫有关。

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S818.9

A

1007-1733(2017)03-0004-02

2016-11-25）

山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目（SDAIT-13-011-05）

*通讯作者