CD117和Sox10在恶性黑色素瘤中的表达及意义

温莉虹，林瑞泼，陈阿德，黄兆浪，郑向阳，李秧秧，黄卡特，陈国荣

（1.温州医科大学附属苍南医院 病理科，浙江 温州 325800；2.温州医科大学附属苍南医院 科教科，浙江 温州 325800；3.温州医科大学附属苍南医院 检验科，浙江 温州 325800；4.温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015）

CD117和Sox10在恶性黑色素瘤中的表达及意义

温莉虹1，林瑞泼2，陈阿德3，黄兆浪1，郑向阳1，李秧秧4，黄卡特4，陈国荣4

（1.温州医科大学附属苍南医院 病理科，浙江 温州 325800；2.温州医科大学附属苍南医院 科教科，浙江 温州 325800；3.温州医科大学附属苍南医院 检验科，浙江 温州 325800；4.温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015）

目的:分析黏膜、肢端和非肢端皮肤恶性黑色素瘤（MM）中CD117和Sox10表达以及c-kit基因扩增情况，探讨其与临床病理的关系。方法:PCR法检测黏膜、肢端和非肢端MM中c-kit基因的扩增量，并以色素痣作为对照。免疫组织化学法检测黏膜、肢端和非肢端MM中CD117的表达量，并与色素痣进行对照。免疫组织化学法检测黏膜、肢端和非肢端MM中Sox10、S-100和HMB45的表达，比较分析各组阳性细胞数及总的阳性率差异。结果:黏膜、肢端和非肢端MM中c-kit基因扩增量显著大于色素痣，差异有统计学意义（P＜0.05）。黏膜、肢端、非肢端MM和色素痣中CD117阳性率分别为78.5%、73.6%、73.3%和25.0%，3组MM阳性率均高于色素痣（P＜0.05）。3组MM中Sox10的阳性细胞数均高于S-100和HMB45，差异有统计学意义（P＜0.05）；Sox10、S-100和HMB45在MM中的阳性率分别为100.0%、87.5%和70.8%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论: c-kit基因扩增及CD117蛋白表达水平增高不仅可作为MM与色素痣的鉴别诊断标志，同时也为MM的靶向治疗提供靶点；Sox10阳性率可作为黑色素细胞起源的肿瘤诊断标志。

黑色素瘤；CD117；c-kit；Sox10；免疫组织化学

恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是来源于皮肤和其他器官黑色素细胞的高度恶性肿瘤[1-3]，以起病隐袭、恶性程度高、转移性强、发展迅速、预后差、病死率高为特点[4-6]。目前缺乏有效的治疗方法，且其病理组织学形态多样，诊断和鉴别诊断存在困难。CD117是一种酪氨酸激酶跨膜受体蛋白[7-8]，在多种类型细胞的信号传导通路中发挥作用，属于c-kit原癌基因蛋白产物，有文献报道称CD117在MM中表达增高[1]。Sox10基因位于染色体22q13.1，编码的蛋白含有466个氨基酸残基，相对分子量约51 kDa，是神经嵴来源细胞的分化标志物，对神经嵴来源的黑色素细胞的分化、成熟和维持起关键作用[9-12]。本研究观察了c-kit基因在MM中的扩增量以及CD117、Sox10蛋白在MM中的表达，探讨MM的诊断、鉴别诊断和可能的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料 收集苍南县人民医院及温州医科大学附属第一医院2008-2014年住院或门诊诊断为MM的组织标本48例（其中黏膜、肢端和非肢端MM分别为14、19和15例），色素痣12例，均经HE染色及病理证实。

1.2 方法

1.2.1 染色:所有标本均经4%中性甲醛溶液固定。

常规脱水、石蜡包埋，切片厚3 μm，行HE染色、免疫组织化学染色。CD117一抗购于上海长岛生物技术有限公司，Sox10、S-100和HMB45一抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司，均为单克隆抗体，以PBS代替一抗作为对照。

1.2.2 免疫组织化学结果判读:CD117细胞浆/膜棕黄色为阳性表达，Sox10细胞核棕黄色为阳性表达，S-100细胞核/浆棕黄色为阳性表达，HMB45细胞浆棕黄色为阳性表达。各组全部样本每例随机选取3个视野计数阳性细胞数，每个视野为195.0 μm× 165.8 μm。

1.2.3 PCR检测:选取CD117阳性的色素痣和MM标本进行PCR检测石蜡包埋组织中c-kit 11外显子基因的表达情况。引物由美国Invitrogen公司合成。引物序列如下:上游:5’-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3’，下游5’-T GACATGGAAAGCCCCTGTT-3’。PCR反应条件为:初始变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40个循环；72 ℃延伸7 min。反应在ABI StepOne中运行。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统SYDR/1960下采集图像并分析。

1.3 统计学处理方法 应用SPSSl7.0统计软件。计量资料用±s表示，组间差异采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD117的表达情况

由图1可见，色素痣细胞胞浆/膜中只见少量棕色颗粒，而黏膜、肢端和非肢端MM瘤细胞胞浆/膜中可见中等量棕色颗粒，说明MM中的CD117表达量显著增高。统计分析结果显示，黏膜、肢端和非肢端MM的阳性细胞数分别为180±5、170±5和170±4，与色素痣（30±2）比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。黏膜、肢端、非肢端MM中CD117阳性率分别为78.5%（11/14）、73.6%（14/19）、73.3%（11/15），高于色素痣的25.0%（3/12），差异有统计学意义（χ2=7.462、7.309、6.328，均P＜0.05）。

图1 CD117在色素痣和MM中的表达（SP，×100）

2.2 c-kit基因扩增情况

由图2可见，黏膜、肢端和非肢端MM分别与色素痣比较，其c-kit基因扩增量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 Sox10表达情况

如图3所示，Sox10为核染，S-100核/浆染色，HMB45为胞浆染色。黏膜、肢端和非肢端MM中的Sox10分别与S-100、HMB45比较，阳性细胞数差异有统计学意义（P＜0.05），见表1；3组MM中Sox10的阳性率为100%，高于S-100的87.5%和HMB45的70.8%，差异有统计学意义（χ2=6.40、16.39，P＜0.05和P＜0.01）。

图2 黏膜、肢端、非肢端MM和色素痣组织中c-kit基因扩增情况

3 讨论

MM是一种高度恶性肿瘤，约占全部皮肤肿瘤的3%，其死亡病例却占皮肤肿瘤的65%[13]。近年来，MM全球发病率呈逐年递增趋势。目前，对于MM的病理诊断较困难，易误诊。MM细胞形态多变，细胞核多形异染，可见噬伊红大核仁，核分裂多见，与部分良性痣如Spitz痣的鉴别存在困难，同时也易与某些上皮及间叶组织的非黑色素细胞来源的肿瘤混淆，因此在病理诊断中对于细胞良恶性及细胞来源的鉴别显得尤为重要。本研究对MM中CD117和Sox10的表达情况进行了探讨，为MM的临床诊断和治疗提供依据。

CD117是原癌基因c-kit的蛋白产物，是一种跨膜的酪氨酸酶受体蛋白，可激活酪氨酸激酶信号传导通路，促进细胞生长、增殖和分化[1，14-15]。本研究通过免疫组织化学法检测色素痣以及黏膜、肢端、非肢端MM中CD117的表达情况，结果显示3组MM样本组织中CD117的表达量及阳性率均高于色素痣，提示CD117可作为鉴别黑色素细胞来源的良恶性肿瘤的标志。CD117表达量取决于c-kit基因的扩增量，本研究PCR检测结果显示，c-kit基因的扩增量与CD117的表达量相一致，MM组织中的c-kit基因扩增量显著大于色素痣，因此，我们推断，MM的发生可能与c-kit基因表达上调有关，故探讨针对c-kit靶点的靶向药物治疗，可能为MM的治疗提供一个新的途径。

图3 黏膜、肢端、非肢端MM中Sox10、S-100和HMB45免疫组织化学染色结果（SP，×100）

表1 Sox10、S-100和HMB45在MM中的阳性细胞数比较（±s）

表1 Sox10、S-100和HMB45在MM中的阳性细胞数比较（±s）

与S-100比:aP＜0.05；与HMB45比:bP＜0.01

Sox10是一种新近发现的黑色素细胞的标记[12]，在神经嵴演变早期背神经管中表达，然后随着神经嵴干细胞的分化，表达于其衍生物如周围神经系统和黑色素细胞中。Sox10与其他转录因子协同指导黑色素细胞发育和分化[16]。本研究发现Sox10在MM中的表达量及阳性率均高于S-100和HMB45，因此Sox10是一种比S-100和HMB45更加有效的黑色素细胞来源的肿瘤标志物，可用于黑色素细胞肿瘤与非黑色素细胞肿瘤的鉴别诊断。

综上所述，本研究结果提示c-kit基因及CD117可作为鉴别黑色素细胞来源的良恶性肿瘤的标志；Sox10可用于黑色素细胞肿瘤与非黑色素细胞肿瘤的鉴别诊断。

[1] 陈文静. 新疆地区恶性黑素瘤c-kit基因突变及CD117表达分析[D]. 乌鲁木齐: 新疆医科大学, 2013.

[2] 倪淑娟, 陈晓晨, 王奇峰, 等. 肛管直肠恶性黑色素瘤c-kit基因突变研究[C]//中华医学会病理学分会2010年学术年会, 2010.

[3] 胡孟钧, 魏建丽. 粘膜原发性恶性黑色素瘤10例病理分析[J]. 温州医学院学报, 1999, 29(3): 253.

[4] CSCO黑色素瘤专家委员会. 中国黑色素瘤诊治指南(2011版)[J]. 临床肿瘤学杂志, 2012, 17(2): 159-171.

[5] GARBE C, PERIS K, HAUSCHILD A, et al. Diagnosis and treatment of melanoma. European consensus-based interdisciplinary guideline-Update 2016[J]. Eur J Cancer, 2016, 63: 201-217.

[6] 李腾政, 罗文, 张吉翔. SOX10在黑色素瘤中的作用[J]. 实用医学杂志, 2015, 1(19): 3267-3268.

[7] WEHRLE-HALLER B. The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis[J]. Pigment Cell Res, 2003, 16(3): 287-296.

[8] GIEHL K A, NAGELE U, VOLKENANDT M, et al. Protein expression of melanocyte growth factors (bFGF, SCF) and their receptors (FGFR-1, c-kit) in nevi and melanoma[J]. J Cutan Pathol, 2007, 34(1): 7-14.

[9] CRONIN J C, WATKINS-CHOW D E, INCAO A, et al. SOX10 ablation arrests cell cycle, induces senescence, and suppresses melanomagenesis[J]. Cancer Res, 2013, 73(18): 5709-5718.

[10] AOKI Y, SAINT-GERMAIN N, GYDA M, et al. Sox10 regulates the development of neural crest-derived melanocytes in Xenopus [J]. Dev Biol, 2003, 259(1): 19-33.

[11] LIU H G, KONG M X, YAO Q, et al. Expression of Sox10 and c-kit in sinonasal mucosal melanomas arising in the Chinese population[J]. Head Neck Pathol, 2012, 6(4): 401-408.

[12] NONAKA D, CHIRIBOGA L, RUBIN B P. Sox10: a panschwannian and melanocytic marker[J]. Am J Surg Pathol, 2008, 32(9): 1291-1298.

[13] DZWIERZYNSKI W W. Managing malignant melanoma[J]. Plast Reconstr Surg, 2013, 132(3): 446-460.

[14] SATZGER I, SCHAEFER T, KUETTLER U, et al. Analysis of c-kit expression and KIT gene mutation in human mucosal melanomas[J]. Br J Cancer, 2008, 99(12): 2065-2069.

[15] POSCH C, MOSLEHI H, SANLORENZO M, et al. Pharmacological inhibitors of c-kit block mutant c-kit mediated migration of melanocytes and melanoma cells in vitro and in vivo[J]. Oncotarget, 2016, 7(29): 45916-45925.

[16] KELSCH R N. Sorting out SOX10 functions in neural crest development[J]. Bio Essays, 2006, 28(8): 788-798.

（本文编辑：丁敏娇）

Expression and signif cance of CD117 and Sox10 in malignant melanoma

Objective:To analyze the value of CD117, Sox10 expression and c-kit gene amplif cation in mucous, acral and non-acral melanoma and explore the relationship between it and clinical pathology.Methods:The gene levels of c-kit in mucosal, acral and non acral melanoma were detected by PCR, with pigmented nevus as control. The protein expressions of CD117, sox10, 1-100 and HMB45 were detected by immunohistochemistry.Results:The expression of c-kit gene from the three MM groups was higher than that of pigmented nevus (P＜0.05). The immunohistochemical results demonstrated that the number of positive cells of CD117 from the three MM groups was marginally higher than that of pigmented nevus (P＜0.05). The number of positive cells of Sox10 in the three MM groups was higher than that of S-100 and HMB45 (P＜0.05). The positive rate of CD117 in mucosal, acral and non acral MM was 78.5%, 73.6% and 73.3% respectively, while 25% in pigmented nevus control (P＜0.05). The positive rate of Sox10, S-100 and HMB45 in MM was 100.0%, 87.5% and 70.8% respectively (P＜0.05).Conclusion:C-kit gene amplif cation and its downstream transcription protein CD117 enhanced positive expression can be applied as clinical potential therapy target. The positive rate of Sox10 is higher than S-100 and HMB45, and may be applied as tumor differentiation marker for origins of melanocytes.

melanoma; CD117; c-kit; Sox10; immunohistochemistry

R365

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.009

2016-09-18

苍南县科技计划项目（2015S05）；温州市科技局科研基金资助项目（Y20130001）；浙江省科技厅国际合作项目（2013C24031）。

温莉虹（1980-），女，浙江苍南人，副主任医师。

陈国荣，教授，主任医师，硕士生导师，Email:chengr1978@aliyun.com。

WEN Lihong1, LIN Ruipo2, CHEN Ade3, HUANG Zhaolang1, ZHENG Xiangyang1, LI Yangyang4, HUANG Kate4, CHEN Guorong4.

1.Department of Pathology, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 2.Department of Science and Education, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 3.Department of Clinical Laboratory, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 4.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015