叶酸抑制血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞去分化

潘孙雷，林辉，孟立平，周昌钻，季政，池菊芳，郭航远

（1.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；2.绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院 心内科，浙江 绍兴 312000）

・论 著・

叶酸抑制血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞去分化

潘孙雷1，2，林辉1，2，孟立平2，周昌钻1，2，季政2，池菊芳2，郭航远1，2

（1.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；2.绍兴市人民医院 浙江大学绍兴医院 心内科，浙江 绍兴 312000）

目的:探究叶酸是否通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/P70S6K信号通路抑制血小板源生长因子（PDGF）-BB诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）的去分化。方法:取SD大鼠的主动脉VSMCs原代细胞进行培养鉴定，第3～第7代细胞用于实验。VSMCs分为5组:Control组、PDGF-BB（浓度为10 ng/mL）组、PDGF-BB+ 1 μmol/L叶酸组、PDGF-BB+10 μmol/L叶酸组、PDGF-BB+100 μmol/L叶酸组。用MTT法检测各组VSMCs的增殖情况；划痕法和Transwell法用于检测各组VSMCs的迁移情况；用Western blot法检测各组VSMCs中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、调宁蛋白（Cal）、骨桥蛋白（OPN）以及mTOR、p-mTOR、P70S6K和p-P70S6K的表达情况。结果:与Control组相比，PDGF-BB组的VSMCs的增殖和迁移能力增加（P＜0.05），OPN、p-mTOR、p-P70S6K的表达增加，α-SMA、Cal表达减少（P＜0.05）。与PDGF-BB组相比，叶酸+PDGF-BB组的VSMCs的增殖和迁移能力减小（P＜0.05），OPN、p-mTOR、p-P70S6K的表达减少，α-SMA、Cal表达增加（P＜0.05），叶酸浓度越高抑制去分化作用越强。结论:叶酸可能通过抑制mTOR/P70S6k信号通路抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的去分化。

平滑肌细胞；叶酸；去分化；mTOR信号通路；大鼠

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在成熟的动物体内仍保持显著的可塑性，在受到外界环境刺激后能进行可逆的从收缩型（分化状态）到合成型（去分化状态）的表型变化。其特征是VSMCs增殖和迁移能力增强，以及细胞外基质蛋白沉积导致内膜增生，并且收缩特异性蛋白表达降低[1]。VSMCs是血管中一类重要的细胞，异常的增殖和迁移与多种心血管疾病，如动脉粥样硬化、血管再狭窄等的发生发展有关。血小板源生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB

是血管损伤后主要由血管内皮细胞和血小板释放，现已被证实是促进VSMCs增殖和迁移的强有力的刺

激因子[2]。因此，本研究中我们用PDGF-BB诱导VSMCs

去分化。近来，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamy-cin，mTOR）信号通路被报道调节许多细胞过程和参与多种疾病的病理生理过程，如癌症、肥胖和2型糖尿病等[3]。mTOR在调节细胞增殖和自噬中扮演重要角色。HUO等[4]报道在高血压患者中，使用叶酸能显著减少第一次中风的发生。叶酸能否抑制PDGF-BB诱导的平滑肌细胞去分化及其确切机制目前仍未清楚。本研究旨在探究叶酸是否能抑制PDGF-BB诱导的VSMCs去分化，并初步探究是否通过mTOR/P70S6K信号通路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级SD大鼠，雌雄不限，6周龄左右，体质量150～180 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号:SYXK（浙）2011-0166，饲养于绍兴市人民医院实验动物中心。本研究实验方案通过绍兴市人民医院动物实验中心伦理委员会批准。

1.1.2 试剂:DMEM高糖培养基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和链霉素（杭州吉诺生物医药技术有限公司），PDGF-BB（美国Sigma公司），胎牛血清（美国Gibco公司），MTT（美国Emresco公司），DAPI（瑞士Rcohe公司），兔来源α平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体、兔来源调宁蛋白（calponin，Cal）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K多克隆抗体、GAPDH抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗、FITC标记的山羊抗兔IgG（美国Jackson公司）。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs原代细胞的培养及鉴定:采用改良的组织贴块法培育大鼠胸主动脉VSMCs，采用形态学观察和细胞免疫荧光检测α-SMA鉴定VSMCs，通过α-SMA与DAPI核染之间的关系鉴定VSMCs的纯度[5]。取第3～第7代细胞用于实验，细胞加干预因素时用含2.5%胎牛血清的培养基。

1.2.2 分组及干预:细胞实验分为5组，分别为Control组（不加任何干预因素）、PDGF-BB（浓度为10 ng/mL）组、PDGF-BB+1 μmol/L叶酸组（1 μmol/L叶酸组）、PDGF-BB+10 μmol/L叶酸组（10 μmol/L叶酸组）、PDGF-BB+100 μmol/L叶酸组（100 μmol/L叶酸组）。

1.2.3 MTT法检测VSMCs增殖:用0.25%的胰蛋白酶消化第3～第7代对数生长期的VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基制成细胞悬液，以每孔5×103个细胞密度接种于96孔培养板中。细胞贴壁后用无血清培养基培养24 h使细胞同步化。各组细胞按上述分组加入对应浓度的干预因子，每组设置5个复孔，2个不加细胞的空白对照孔。用37 ℃、5% CO2孵箱培养细胞12、24、48、72、96 h。培养结束后，每孔加入MTT液20 μL，37 ℃继续孵育4～6 h终止培养，小心弃去培养上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，选择490 nm波长于酶联免疫检测仪测定各孔吸光度（OD）值并记录。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制VSMCs生长曲线。

1.2.4 细胞划痕实验检测VSMCs迁移:用0.25%的胰蛋白酶消化第3～第7代对数生长期的VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基配成细胞悬液并计数，以每孔1×105个细胞密度接种于6孔培养板中，每孔体积为2 mL。当细胞铺满板底后，用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，加入1.8 mmol/L羟基脲作用12 h抑制细胞增殖。用100 μL黄色枪头垂直于孔板制造细胞划痕，吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入各组相应的干预因子，拍照记录0、12、24、48 h图片，用Image Pro Plus6.0软件分析计算细胞迁移的面积，细胞迁移的面积与最开始的划痕面积之间的比值来表示迁移的多少。

1.2.5 Transwell法检测VSMCs迁移:用第3～第7代对数生长期的VSMCs，血清饥饿使细胞同步化，0.25%胰蛋白酶消化单层VSMCs，用含有各组干预因子的DMEM高糖培养基（无血清）配成细胞悬液并计数（3×104个/mL）。各组24孔板配套的Transwell小室（8 μm）上室加入200 μL细胞悬液，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基500 μL，培养24 h。干预结束后以棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMCs，取下Transwell半透膜，TBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定5 min，流水冲洗后，用5 mg/L的DAPI染核，PBS冲洗后，荧光显微镜下随机取5个视野计数穿膜细胞数并记录。

1.2.6 Western blot检测:各组在相应的干预因子干预24 h之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，SDS-PAGE胶每孔加入25 μL样品，80 V 30 min进行蛋白浓聚，120 V 2 h进行凝胶电泳，并用孔径0.45 μm硝酸纤维素膜250 mA 90 min进行转膜。转膜完毕后常温下TBST洗膜3次、脱脂奶粉封闭2 h后，以1：1 000浓度加入α-SMA一抗（或抗Cal、OPN以及p-mTOR、mTOR、p-P70S6k、P70S6K、GAPDH一抗），在4 ℃孵育过夜，常温下TBST洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育后用ECL化学发光法检测目标蛋白和内参。于暗室柯达胶片显影，用Quantity one软件定量分析。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析。实验数据以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，各组均数间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs原代培养及鉴定 用组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs，7 d左右组织块周围有细胞爬出，14 d左右细胞融合可以传代。传代后细胞呈典型“峰谷”状排列生长，用α-SMA细胞免疫荧光鉴定VSMCs，DAPI核染之后将2组照片融合，鉴定细胞纯度在99%以上，见图1。

图1 主动脉VSMCs原代培养

2.2 MTT法检测VSMCs的增殖情况 加入各组干预因素，12 h后各组之间的OD值并无明显差异。从24 h开始，与Control组相比，PDGF-BB组的OD值明显升高（P＜0.05）；与PDGF-BB组相比，1 μmol/L叶酸组、10 μmol/L叶酸组和100 μmol/L叶酸组的OD值均明显下降（P＜0.05），并且随叶酸浓度增加，OD值下降更明显。该实验表明PDGF-BB具有促进VSMCs增殖的作用；叶酸具有抑制PDGF-BB诱导VSMCs增殖的作用，并且随叶酸的浓度增加，抑制作用增强，见图2。

图2 VSMCs在各组干预因素干预下不同时间的增殖

2.3 细胞划痕实验检测VSMCs迁移 细胞划痕之后，加入各组干预因素干预12、24、48 h，在光学显微镜下观察VSMCs的迁移，从24 h开始，与Control组相比，PDGF-BB组的VSMCs的迁移距离明显增加（P＜0.05）；与PDGF-BB组相比，1 μmol/L叶酸组、10 μmol/L叶酸组、100 μmol/L叶酸组的VSMCs的迁移距离减少（P＜0.05），且随叶酸浓度增加，VSMCs的迁移距离明显减少，见表1。该实验表明PDGF-BB具有促进VSMCs迁移的作用；叶酸具有抑制PDGF-BB诱导VSMCs迁移的作用，并且随叶酸的浓度增加，抑制作用增强，见图3。

表1 VSMCs在各组干预因素干预下不同时间的迁移面积/划痕面积（%，n=5，±s）

表1 VSMCs在各组干预因素干预下不同时间的迁移面积/划痕面积（%，n=5，±s）

与Control组比:aP＜0.05；与PDGF-BB组比:bP＜0.05

2.4 Transwell法测VSMCs迁移 24 h后100倍显微镜下1个视野内VSMCs穿透Transwell小室进入下室的细胞数PDGF-BB组（579±7.5）与Control组（114± 5.6）相比明显增多（P＜0.05）；与PDGF-BB组相比，1 μmol/L叶酸组（385±4.2）、10 μmol/L叶酸组（291±5.8）、100 μmol/L叶酸组（165±6.9）穿透细胞数减少（P＜0.05），并且随叶酸浓度增加，VSMCs的穿透明显减少，见图4。

2.5 Western blot检测VSMCs中α-SMA、Cal、OPN的表达 干预24 h之后，与Control组比，PDGFBB组α-SMA、Cal的表达明显下降（P＜0.05），OPN的表达明显上升（P＜0.05）；与PDGF-BB组相比，1 μmol/L叶酸、10 μmol/L叶酸、100 μmol/L叶酸组的α-SMA、Cal的表达上升（P＜0.05），OPN的表达下降（P＜0.05），并且随叶酸浓度增加，α-SMA、Cal的表达明显上升，OPN的表达明显下降。表明PDGFBB具有诱导VSMCs去分化的作用；叶酸具有抑制PDGF-BB诱导VSMCs去分化的作用，并且随叶酸的浓度增加，抑制去分化作用增强，见图5。

图3 VSMCs在各组干预因素干预24 h后的迁移

图4 24 h后荧光显微镜1个视野内VSMCs穿透Transwell小室的数量（×100）

2.6 Western blot检测VSMCs中p-mTOR、mTOR、p-P70S6k、P70S6K的表达 干预24 h之后，与Control组相比，PDGF-BB组p-mTOR、p-P70S6K的表达明显上升（P＜0.05）；与PDGF-BB组相比，1 μmol/L叶酸、10 μmol/L叶酸、100 μmol/L叶酸组的p-mTOR、p-P70S6K的表达下降（P＜0.05），并且随叶酸浓度增加，p-mTOR、p-P70S6K的表达明显下降。表明PDGF-BB具有激活mTOR/P70S6K信号通路的作用；叶酸具有抑制PDGF-BB激活VSMCs的mTOR/P70S6K信号通路的作用，并且随着叶酸浓度的增加，抑制PDGFBB激活VSMCs的mTOR/P70S6K信号通路的作用越强，见图6-7。

3 讨论

VSMCs在成熟动物体内是一种高度分化的细胞，其主要功能是收缩、调节血管直径和血压以及血流分布。与骨骼和心肌等终末分化细胞不同，VSMCs在成熟动物体内仍保持显著的可塑性，在受到外界环境刺激后能进行可逆的表型变化。在正常情况下，平滑肌细胞保持静止和非迁移状态，在各种生长因子和细胞因子的刺激下，平滑肌细胞去分化，其增殖和迁移能力增强[6]。VSMCs的表型改变与多种心血管疾病包括动脉粥样硬化、高血压、血管狭窄相关，在心血管疾病的发生发展中起重要作用[7]。多种治疗心血管疾病的药物机制之一就是抑制平滑肌细胞的去分化[8]。本实验探究叶酸是否能抑制PDGF-BB诱导的平滑肌细胞去分化，并初步探究叶酸抑制PDGF-BB诱导的平滑肌细胞去分化的可能机制。

叶酸是一种水溶性维生素，是机体细胞生长和繁殖的必需物质。GUO等[9]报道叶酸可以降低同型半胱氨酸诱导的VSMCs MMP2和MMP9的表达降低。HAN等[10]报道叶酸可以拮抗同型半胱氨酸诱导的平滑肌增殖和异常的PDGF甲基化。在本研究中，我们通过MTT、划痕实验及Transwell实验发现叶酸能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖和迁移，并随着叶酸的浓度增加，抑制作用增加。在Western blot中，我们发现叶酸能升高由PDGF-BB诱导VSMCs去分化所致的降低的α-SMA和Cal蛋白表达，和降低由PDGF-BB诱导VSMCs去分化所致的升高的OPN蛋白表达。

PDGF家族由PDGF-A，-B，-C，-D 4种组成。PDGF可以和受体PDGFR-a和PDGFR-b相互作用，并存在受体依赖性和细胞特异性[2]。PDGF-BB是VSMCs重要的一种促细胞分裂素和趋化因子，在各种心血管疾病的发生和发展中扮演重要角色。PDGF-BB启动多种生物学效应的细胞内信号转导通路，促进VSMCs表型转化，活化增殖、迁移[11]。RANI等[12]报道鞣花酸能抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖和迁移。CHEN等[13]报道阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs去分化。在本研究中同样发现，PDGF-BB能促进VSMCs的增殖和迁移，并增加去分化型蛋白OPN的表达，降低分化型特异性的收缩蛋白α-SMA和Cal，与上述文献报道一致，表明本实验用PDGF-BB成功诱导VSMCs去分化。

图5 各组干预因素干预24 h α-SMA、Cal、OPN的表达

图6 各组干预因素干预24 h p-mTOR、mTOR的表达

图7 各组干预因素干预24 h p-P70S6k、P70S6K的表达

mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）相关的激酶家族，在调控许多通路的信号传导中发挥着重要作用，包括胰岛素信号、营养传感信号和有丝分裂信号[3]。mTOR是一种广泛表达的蛋白激酶，通过P70S6K和4E-BP1/ eIF4E信号通路调节特异性生长相关的mRNA翻译起始因子。mTOR信号通路通过氨基酸反应合成蛋白，通过PI3K通路协同调控蛋白质的合成，细胞周期进程和增殖[14]。OSMAN等[15]报道吡格列酮可以降低PDGF-BB诱导的mTOR活化和降低P70S6K的磷酸化，从而抑制平滑肌细胞增殖。在本研究中，我们发现叶酸能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的mTOR和P70S6K磷酸化。猜测叶酸可能通过抑制mTOR/P70S6K信号通路抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的去分化。

本实验通过PDGF-BB诱导VSMCs去分化，证实叶酸能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs去分化，并随叶酸浓度的增加抑制作用增强。在此基础上，初步推测叶酸可能是通过抑制mTOR/P70S6K通路实现这一作用，接下来我们将进一步用雷帕霉素抑制mTOR/ P70S6K信号通路和MHY-1485激活mTOR/P70S6K信号通路与叶酸进行对比，来证实叶酸是否通过抑制mTOR/P70S6K通路从而抑制PDGF-BB诱导的VSMCs去分化。

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（本文编辑：赵翠翠）

Folic acid inhibits platelet-derived growth factor-induced vascular smooth muscle cell dedifferentiation

PAN Sunlei1,2, LIN Hui1,2, MENG Liping2, ZHOU Changzuan1,2, JI Zheng2, CHI Jufang2, GUO Hangyuan1,2.
1.The First Clinical Medical College, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Cardiology, Shaoxing People’s Hospital, Shaoxing Hospital of Zhejiang University, Shaoxing, 312000

Objective:To explore whether folic acid through the mammalian target of rapamycin (mTOR)/ P70S6K signaling pathway to inhibit platelet derived growth factor (PDGF-BB) induced vascular smooth muscle cells (VSMCs) dedifferentiate.Methods:SD rats aortic VSMCs primary cells were cultured and identif ed, and the 3-7th generations of cells were used for the experiment. The VSMCs were divided into 5 groups: control, PDGF-BB (10 ng/mL), PDGF-BB+1 μmol/L folic acid, PDGF-BB+10 μmol/L folic acid, PDGF-BB+100 μmol/L folic acid. MTT method was used to detection the proliferation of VSMCs in each group. The migratory ability of VSMCs were determined by Wound-Healing assay and Transwell chambers assay. Western blot was used to investigated the expressions of alpha-smooth muscle actin (α-SMA), calponin (Cal), osteopontin (OPN), mTOR, p-mTOR, P70S6K and p-P70S6K in each group.Results:Compared with the control group, the proliferation, migration and the expression of OPN, p-mTOR and p-P70S6K were increased signif cantly in the VSMCs of PDGF-BB group (＜0.05), and the expression of α-SMA and Cal significantly decreased in the VSMCs of PDGF-BB group (P＜0.05). Compared with the PDGF-BB group, the proliferation, migration and the expression of OPN, p-mTOR and p-P70S6K were decressed signif cantly in the VSMCs of each folic acid group (P＜0.05), and the expression of α-SMA and Cal signif cantly increased in the VSMCs of each folic acid group (P＜0.05). Folic acid inhibited the PDGF-BB induceing VSMCs dedifferentiation in a dose-dependent manner.Conclusion:Folic acid may inhibit the differentiation of VSMCs induced by PDGF-BB through suppression mTOR/P70S6k signaling pathway.

vascular smooth muscle cells; folic acid; dedifferentiation; mTOR signaling pathway; rats

R363.2；R543.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.002

2016-06-22

浙江省自然科学基金资助项目（LY14H020002，Y14H020009）；浙江省科技厅公益项目（2016C33227）。

潘孙雷（1992-），男，浙江温州人，硕士生。

郭航远，主任医师，教授，博士生导师，Email:ghangyuan@hotmail.com。