SIAH2与MMP2在非小细胞肺癌中的表达及其意义

杨志强，温媛媛，李略

（舟山医院 呼吸内科，浙江 舟山 316021）

SIAH2与MMP2在非小细胞肺癌中的表达及其意义

杨志强，温媛媛，李略

（舟山医院 呼吸内科，浙江 舟山 316021）

目的:研究SIAH2与金属基质蛋白酶2（MMP2）在人非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达，并分析其与肺癌临床病理特征的关系。方法:采用免疫组织化学S-P法检测120例NSCLC石蜡包埋组织中SIAH2与MMP2蛋白的表达情况，分析其表达与临床病理因素之间的相关性。采用脂质体介导法将SIAH2干扰片段SIAH2 siRNA转染入肺癌细胞系A549和SK-MES-1后，利用RT-PCR和Western blot法检测SIAH2与MMP2在mRNA和蛋白水平的表达情况。干扰SIAH2表达后，应用MTT法、Transwell法检测SIAH2对肺癌细胞增殖和侵袭的影响。结果:SIAH2与MMP2在NSCLC中高表达，其高表达与肺癌高TNM分期（P=0.019，P=0.020）、低分化（P=0.024，P=0.011）和淋巴结转移（P=0.032，P=0.021）显著相关。SIAH2与MMP2在NSCLC中表达呈正相关（r=0.321，P＜0.01），SIAH2与MMP2在肺癌细胞系中高表达。干扰SIAH2表达后，与未处理组及转染对照片段control siRNA组相比，SIAH2与MMP2的mRNA（P＜0.05）和蛋白（P＜0.05）表达均明显下降，细胞生长增殖能力[P＜0.01（2～4 d）；P＜0.01（2～4 d）]减弱，细胞侵袭数目（17.61±4.34；20.12±5.43）（P＜0.05）减少。结论:高表达SIAH2在NSCLC的恶性进程中起重要作用，MMP2可能参与了此恶性表型的形成过程。

癌，非小细胞肺；SIAH2；金属基质蛋白酶2；增殖；侵袭

SIAH（seven in absentia homolog）家族蛋白是果蝇属SINA蛋白的同系物，人类有2个高度保守的同源SIAH:SIAH1与SIAH2。siah2基因定位于3q25号染色体，编码324个氨基酸，其蛋白产物是一种环指泛素连接酶，在其N端有环形催化结构域（ring finger domain，RFD），C端有底物结合结构域（substrate binding domin，SBD），它们之间有2个锌指结构[1]。SIAH2与恶性肿瘤的发生发展密切相关。研究表明，SIAH2在口腔鳞状细胞癌[2]、卵巢癌[3]、胰腺癌[4]、乳腺癌[5]和肝癌[6]中均高表达。

肿瘤的侵袭转移与细胞外基质的降解和金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）密切相关，MMP2作为MMPs的重要组成成员在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。研究发现，MMP2在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表达明显高于癌旁正常组织，且与淋巴结转移和临床分期呈正相关[7]。MMP2在肝癌中高表达，且与肝癌细胞侵袭转移有关[8]。MMP2在喉癌患者中高表达，与喉癌不良预后相关[9]。

SIAH2与MMP2在肿瘤中的相互关系尚未见报道。本研究拟采用免疫组织化学法、免疫印迹法及RTPCR法检测SIAH2与MMP2在NSCLC组织和细胞中的表达情况，分析其表达的相关性及其与肺癌患者临床病理因素之间的关系。采用RNA干扰技术，观察沉默siah2基因表达后，对NSCLC细胞增殖和侵袭能力的影响以及MMP2的表达情况，探讨SIAH2与MMP2在肺癌发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 收集浙江省舟山医院病理科2005年至2012年原发性NSCLC患者手术切除标本存档蜡块120例，所有患者术前均未接受放、化疗。其中男66例，女54例。年龄33～76岁（中位年龄57岁）。按WHO（2010）组织学分类标准:鳞状细胞癌53例，腺癌67例。按国际抗癌联盟（UICC）2002年修订的TNM分期标准:I期40例，I I期28例，I I I期39例，IV期13例。淋巴结转移61例，无淋巴结转移59例。标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，HE常规染色后明确诊断。所有标本的使用均通过了本院伦理委员会审核且患者本人知情同意。

1.2 主要试剂 免疫组织化学S-P检测试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒（DAB-0031，福州迈新生物技术公司）；鼠抗人SIAH2抗体、鼠抗人MMP2抗体、SIAH2 siRNA（美国Santa Cruz公司），β-actin抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；DMEM培养液、胎牛血清（美国Gibco公司）；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美国Sigma公司）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒（大连TaKaRa公司），PCR引物合成与测序委托大连TaKaRa公司进行。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色及结果判定:组织经中性福尔马林固定、石蜡包埋，制成4 μm连续切片。按照免疫组织化学S-P检测试剂盒说明书步骤进行SIAH2（1：200）和MMP2（1：150）免疫组织化学染色。PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。SIAH2和MMP2判定标准:SIAH2以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色，MMP2以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。每张切片随机选取5个高倍视野（×400），每高倍视野计数100个目的细胞。将表达阳性率分为以下4个等级:≤25%为0分，26%～50%为1分，51%～75%为2分，＞75%为3分。根据免疫组织化学染色强度分为3个等级:无着色计为0分，浅黄色颗粒计为1分，棕黄色颗粒计为2分。以SIAH2或MMP2表达阳性率和染色强度的分值乘积作为总积分，积分≥3分者判定为阳性，积分＜3分者判定为阴性。

1.3.2 细胞培养:人正常支气管上皮细胞系（HBE）、人肺腺癌细胞系（A549、Lu165）、人肺鳞癌细胞系（SK-MES-1、NCI-H520）、人肺巨细胞癌细胞系（PGLH7）6种细胞均为贴壁生长的细胞系，均接种在DMEM培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，于37 ℃含5% CO2湿润空气的培养箱中培养。

1.3.3 RNA干扰:使用脂质体Lipofectamine 2000将siRNA导入肺癌细胞系A549与SK-MES-1中（具体步骤按试剂说明书进行）。阴性对照组分未转染组和control siRNA转染组。转染48 h后进行后续Western blot和RT-PCR检测。

1.3.4 Western blot:收集细胞，加入裂解液，4 ℃静置24 h，低温高速离心（4 ℃，12 000 r/min，40 min），提取上清即为总蛋白。经电泳、转印，5%正常小牛血清封闭，抗SIAH2（1：500）、抗MMP2（1：400）和抗β-actin（1：500）4 ℃下孵育，过夜；二抗于室温下孵育2 h；ECL显色，X线胶片曝光成像，经自动电泳凝胶成像分析仪采集图像。

1.3.5 RT-PCR:采用Trizol试剂提取细胞总RNA，利用RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒反转录获得cDNA，扩增SIAH2和MMP2，以β-actin为内参。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后成像分析。SIAH2PCR上游引物:5’-ATGGGAACCTTGGAATCAATG-3’；下游引物:5’-CACAGAACCACCTCCGAATTA-3’。MMP2 PCR上游引物:5’-GGCCTCTCCTGACATTGACCTT-3’；下游引物: 5’-GGCCTCGTATACCGCATCAATC-3’。β-actin PCR上游引物:5’-CGGCATTGTCAGCAACTG-3’；下游引物:5’-CGC TCGGTCAGGATCTTC-3’。

1.3.6 MTT法:将单个细胞悬液分别接种于96孔培养板中，每孔含1×104个细胞，培养24 h，每孔加入MTT溶液继续培养4 h，加入DMSO，490 nm波长下测定各孔吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照，绘制细胞生长曲线。

1.3.7 基质胶侵袭实验（Transwell侵袭小室测定）:在Transwell侵袭小室上室加入100 μL预冷的Matrigel基质胶（按基质胶与无血清DMEM培养基1：7稀释），下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，将转染后24 h的肺癌细胞接种到上室，并于37 ℃含5% CO2孵箱中培养32 h后吸尽培养基，PBS清洗后，甲醇室温下固定15 min，用棉签擦掉微孔膜上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。取下微孔膜，置载玻片上，显微镜下计数侵袭至滤膜下表面的细胞数，每张滤膜随机计数10个视野（×400），取均值。实验重复3次。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。计量资料用±s表示，免疫组织化学染色结果采用pearson Chi-Square检验；RT-PCR、Western blot、MTT和细胞侵袭实验结果均采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIAH2与MMP2蛋白在NSCLC组织中的表达 SIAH2与MMP2蛋白在NSCLC组织中高表达，且与肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴结转移相关。免疫组织化学结果显示，在120例NSCLC石蜡标本中，SIAH2在84例（占70.0%）肺癌标本中呈核表达强阳性，MMP2在91例（占75.8%）肺癌标本中呈现胞质强阳性。在人肺正常支气管黏膜上皮细胞中，SIAH2与MMP2蛋白表达阴性或弱阳性，见图1。对120例NSCLC中SIAH2和MMP2表达进行相关性分析，spearman相关性检验结果显示，SIAH2与MMP2表达呈正相关（r= 0.321，P＜0.01），见表1。

图1 SIAH2与MMP2在NSCLC中的表达（SP，×200）

表1 120例NSCLC组织标本中SIAH2和MMP2蛋白表达的相关性

进一步分析120例NSCLC组织中SIAH2与MMP2蛋白表达与临床病理因素之间的关系发现，SIAH2和 MMP2的高表达与肺癌的低分化（P=0.024，P=0.011）、高TNM分期（P=0.019，P=0.020）及淋巴结转移显著相关（P=0.032，P=0.021）。其中，在54例低分化病例中有49例（占90.7%）SIAH2和50例MMP2（占92.4%）高表达；I I I～IV期病例中有48例（占92.3%）SIAH2和47例（占90.4%）MMP2存在高表达；在伴有淋巴结转移的病例中，53例（占86.9%）SIAH2与54例（88.5%）MPP2存在高表达。SIAH2与MMP2的高表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小和组织学类型无明显相关性（P＞0.05），见表2。

2.2 SIAH2与MMP2在肺癌细胞系中高表达 RT-PCR和Western blot结果显示，SIAH2与MMP2 mRNA和蛋白在人肺腺癌细胞系（A549、Lu165）、人肺鳞癌细胞系（SK-MES-1、NCI-H520）、人肺巨细胞癌细胞系（PGLH7）表达高于正常支气管上皮细胞系（HBE）（P＜0.05），见图2。

表2 120例NSCLC中SIAH2和MMP2的表达与临床病理学参数之间的关系[ n（%）]

图2 SIAH2与MMP2在肺正常支气管上皮细胞系与肺癌细胞系中的表达

2.3 沉默SIAH2表达后SIAH2与MMP2 mRNA和蛋白表达均下调 在肺癌细胞系A549与SK-MES-1中瞬时转染SIAH2 siRNA 48 h后，RT-PCR和Western blot结果显示，与未处理组及control siRNA组比较，2种肺癌细胞中SIAH2 mRNA和蛋白表达均显著下调，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3，证明实验所采用的SIAH2 siRNA干扰效果是确定的。同时在转染SIAH2 siRNA 48 h后，RT-PCR和Western blot检测到MMP2 mRNA和蛋白表达也显著下调（P＜0.05），见图3。

图3 干扰SIAH2表达后SIAH2与MMP2在肺癌细胞系中的表达情况

2.4 沉默SIAH2表达可抑制肺癌细胞的侵袭 Transwell实验结果表明，肺腺癌细胞系A549与肺鳞癌细胞系SK-MES-1转染SIAH2 siRNA（17.61±4.34；20.12±5.43）后侵袭细胞数与control siRNA组（126.16±15.41；150.32±23.44）和未处理组（118.45±10.36；138.76±18.63）比较明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 干扰SIAH2表达后A549与SK-MES-1细胞侵袭数目明显减少

2.5 沉默SIAH2表达可抑制肺癌细胞的增殖 MTT实验结果表明:在肺癌细胞系A549和SK-MES-1中转染SIAH2 siRNA 1 d后，与control siRNA组或未处理组比，细胞相应的吸光度值无明显改变（P＞ 0.05）。但在转染SIAH2 siRNA 2～4 d后，细胞吸光度值较第1天有明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）（见图5A、B）。以上结果提示:沉默SIAH2表达可显著抑制肺癌细胞的增殖能力。

图5 干扰SIAH2表达后，肺癌细胞系A549与SK-MES-1细胞增殖能力减弱

3 讨论

有研究[10]报道，SIAH2在乳腺癌中高表达，与临床分期呈正相关，且与乳腺癌恶性程度和肿瘤进展密切相关。GAO等[3]采用免疫组织化学研究发现，在122例卵巢癌中SIAH2高表达，与卵巢癌的组织学分级和淋巴结转移呈正相关，这提示SIAH2与卵巢癌的发生发展及恶性进程相关。SIAH2在肺鳞状细胞癌中高表达，随着肺癌的恶性进展表达增高，且可通过增加TYK2的蛋白酶降解途径来抑制STAT3通路的活性[11]。本研究免疫组织化学结果发现在120例NSCLC石蜡标本中，SIAH2在NSCLC组织中高表达，且SIAH2高表达与肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴结转移显著相关。RT-PCR与Western blot结果发现，SIAH2在NSCLC细胞中表达明显高于正常支气管黏膜上皮细胞。这些研究结果提示高表达SIAH2在NSCLC的恶性进展中起重要作用。

沉默SIAH2表达可抑制肺癌细胞增殖、促进细胞凋亡与抑制裸鼠成瘤[12]。抑制SIAH2泛素连接酶可阻止恶性黑色素肿瘤形成[13]。干扰SIAH2表达可通过p53依赖途径来抑制细胞生长、促进细胞凋亡[14]。以上研究都表明SIAH2与肿瘤细胞的生长、侵袭、增殖密切相关。本研究发现，与未处理组和control siRNA组比较，干扰SIAH2表达后，肺癌细胞系A549和SK-MES-1增殖能力显著降低，侵袭能力明显减弱。

SIAH2可通过2条途径调控肿瘤的形成与生长侵袭，即SIAH2/Ras或SIAH2/HIF-1α通路[15]。在缺氧环境下，SIAH2可调控HIF-1α的表达[16]，降低SIAH2的活性可通过HIF-1α途径来抑制肿瘤细胞转移[17]。过表达HIF-1α可通过上调MMP2的表达与增加其活性来促进肺腺癌细胞的侵袭转移[18]。基于以上研究结果，我们推测SIAH2可能通过调控MMP2的表达来影响肺癌细胞的生物学行为。免疫组织化学结果表明MMP2在NSCLC组织中高表达，与肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴结转移显著相关，且SIAH2与MMP2表达呈正相关。RT-PCR与Western blot结果发现MMP2在NSCLC细胞中表达高于正常支气管上皮细胞。我们采用SIAH2 siRNA干扰SIAH2表达后，RT-PCR与Western blot检测结果发现MMP2表达明显下降。这些结果都表明SIAH2与MMP2在NSCLC中密切相关，SIAH2可能通过MMP2来发挥生物学作用，具体机制有待于我们进一步研究。

综上所述，SIAH2在NSCLC恶性进程中发挥重要作用，MMP2可能参与其中，这将为SIAH2调控肿瘤生长侵袭的机制研究提供新思路。

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（本文编辑：赵翠翠）

Expression and significance of SIAH2 and MMP2 in non-small cell lung cancer

YANG Zhiqiang, WEN Yuanyuan, LI Lue.
Department of Respiratory Medicine, Zhoushan Hospital, Zhoushan, 316021

Objective:To study the SIAH2 and MMP2 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC), and analyze the relationship between the expression and clinical pathological features and the malignant degree of lung cancer.Methods:Immunohistochemistry S-P method was used to examine the expression of SIAH2 and MMP2 protein in 120 paraff n-embeded specimens with NSCLC, and analyzed the correlation between the expression and clinical pathological factors. The expressions of SIAH2 and MMP2 were detected by RT-PCR and Western blot in lung cancer cell lines. We transfected SIAH2 siRNA into A549 and SK-MES-1 cells using Lipofectamine 2000, and then detected the SIAH2 and MMP2 mRNA and protein expression by RT-PCR and Western blot, thus tested the cell proliferation and cell invasion by MTT and Transwell respectively.Results:Immunohistochemical analysis showed that SIAH2 and MMP2 expression levels were signif cantly higher in NSCLC tissues and signif cantly associated with the higher TNM stage (P=0.019, P=0.020), poor differentiation (P=0.024, P=0.011), and lymph node metastasis (P=0.032, P=0.021). SIAH2 protein expression was positively correlated with MMP2 in NSCLC (r=0.321, P＜0.01). The expression of SIAH2 and MMP2 were higher in lung cancer cells than in normal bronchial epithelial cell (P＜0.05). Compared with the untreated and control siRNA group, the levels of SIAH2 and MMP2 mRNA and protein were decreased in the cells transfected with the SIAH2 siRNA, respectively (P＜0.05). The proliferation rate [P＜0.01 (day 2-4); P＜0.01 (day 2-4)] was slower, and invasion number (17.61±4.34; 20.12±5.43) was decreased in the cells transfected with the SIAH2 siRNA (P＜0.05).Conclusion:Up-regulation of SIAH2 plays an important role in the process of malignant phenotype in human NSCLC, and MMP2 may be involved in this process.

carcinoma, non-small cell lung; seven in absentia homolog; matrix metalloproteinase; proliferation; invasion

R734

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.003

2016-06-22

国家自然科学基金资助项目（81201853）；浙江省自然科学基金资助项目（LY16H160058）；浙江省医药卫生科技计划资助项目（2015121805）。

杨志强（1981-），男，山西临汾人，主治医师，博士。

温媛媛，副主任医师，Email:wenyuanyuan@sina.cn。