组织型纤溶酶原激活物突变体对鼠急性脑梗死及脑组织保护作用实验研究

侯沛秋，祝 丹，唐 曦，林 川，曾大奎

组织型纤溶酶原激活物突变体对鼠急性脑梗死及脑组织保护作用实验研究

侯沛秋1，祝 丹1，唐 曦2，林 川3，曾大奎3

（1.成都医学院 医学影像系，四川 成都 610500；2.成都医学院第一附属医院 医学影像系，四川 成都 610500；3.四川省宜宾市第二人民医院 肿瘤二科，四川 宜宾 644000）

目的 评价新型组织型纤溶酶原激活物突变体（t-PAm）对鼠急性脑梗死溶栓作用及脑组织保护作用。 方法 84只成年Wistar大鼠随机分为对照组、组织型纤溶酶原激活物组（t-PA）、低剂量组织型纤溶酶原激活物突变体组（低剂量t-PAm组）及常规剂量组织型纤溶酶原激活物突变体组（常规剂量t-PAm组），大脑中动脉血栓形成3 h后进行相应治疗。观察溶栓24 h后脑梗死面积、神经损伤评分、脑出血的情况，并通过中性粒细胞浸润及蛋白酶激活受体1（PAR-1）浓度的变化了解t-PAm对脑组织的保护作用。结果 梗死后应用低剂量t-PAm[（108.5±27.3）mm3]及常规剂量t-PAm[（68.3±17.2）mm3]组梗死面积均较对照组降低，同时梗死面积与神经评分有明确的相关性（r=0.613，P=0.000），且低剂量t-PAm在溶栓的同时没有明显增加脑出血的概率。t-PAm还减少髓过氧化物酶的生成，并与t-PA组相比减少PAR-1的生成（P＜0.001）。结论 新型组织型纤溶酶原激活物突变体有较好的溶栓作用，同时对缺血脑组织有明显的保护作用。

尿激酶；血栓；组织型纤溶酶原激活物；突变体

脑组织具有不可再生的特点，随着脑梗死时间的延长，脑细胞坏死逐渐增加，因此，尽早开通闭塞血管有着决定性的意义。溶栓剂被广泛应用在急性脑梗死中，目前急性脑梗死的溶栓窗限定在血栓形成后3 h内，延迟溶栓增加脑出血及血脑屏障损伤的风险，同时增加其他脑血管疾病的发生率。因此，寻找一个疗效好、副作用低的溶栓剂会给患者及社会带来极大的益处[1-5]。本实验重点观察新型组织型纤溶酶原激活物突变体（tissue type plasminogen activator mutant，t-PAm）对大鼠急性脑梗死的溶栓疗效。本研究希望新药t-PAm能减少出血风险，提高再通率，并对缺血再灌注的脑组织有保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

84只雄性成年Wistar大鼠，平均体重（332± 19）g，合格证号：SCXK（沪）2013-0009（上海大学医学院）。爱通立粉剂（德国勃林格殷格翰公司），普通肝素（常州千红生物制药有限公司），2，3，5-氯化三苯四唑（上海源叶生物科技有限公司），戌二醛固定液（常州千红生物制药有限公司），0.1%四氮唑蓝溶液（深圳中晶生物技术有限公司），异氟醚（杭州维康科技有限公司），三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（广州伟伯化工有限公司），0.05%聚环氧乙烯月桂酰醚（深圳铭科化工有限公司），1%聚乙二醇辛基苯基醚（广州伟伯化工有限公司），10%聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶（天津比克化学科技有限公司），抗髓过氧化物酶（Myelopero xidase，MPO）的鼠单克隆抗体（上海叶民生物技术有限公司），兔多克隆抗体（南京金斯瑞生物科技有限公司），β-微管蛋白（北京博奥森生物技术有限公司），抗兔二抗（上海欧韦达仪器科技有限公司），山羊抗小鼠多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（上海西唐生物科技有限公司），链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）（武汉博士德生物工程有限公司），二氨基联苯氨（Diaminobezidin，DAB）（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 84只雄性成年Wistar大鼠，平均体重（332±19）g，异氟醚麻醉（5%诱导，2%手术，1.2%维持）。恒温加热装置使大鼠肛温控制在（37.0±0.5）℃。体外复制新鲜血栓（直径=0.35 mm，长度=18 mm），注射入鼠的右侧大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）形成急性脑梗死[6]。急性脑梗死形成3 h后大鼠被随机分入下列4组：对照组，使用生理盐水；组织型纤溶酶原激活物组（t-PA组），采用爱通立粉剂，总量10 mg/kg（其中10%剂量溶于盐水后静脉推注，余量用微量泵在30 min内匀速泵入体内）；常规剂量组织型纤溶酶原激活物突变体组（常规剂量t-PAm组），用法与t-PA组类似，总量10 mg/kg（其中10%剂量溶于盐水后静脉推注，余量用微量泵在30 min内匀速泵入体内）；低剂量组织型纤溶酶原激活物突变体组（低剂量t-PAm组），总量5 mg/kg，用法与t-PA组相似[7-8]。血栓形成后24h后断头法处死小鼠。

1.2.2 梗死面积测量、神经系统损伤评分及脑出血评价 大鼠脑组织切片，应用2，3，5-氯化三苯四唑染色评估梗死面积。采用9分法评价神经系统损伤，0分=正常，9分=最重损伤[9-12]。用药后大鼠脑出血评价大鼠脑组织沿冠状沟切成1.5mm薄片，肉眼分析脑出血情况，分为：①HI-1型（hemorrhagic infarction type 1，HI-1），定义为梗死区周围有点状出血；②HI-2型（hemorrhagic infarction type 2，HI-2），定义为梗死区周围有片状出血；③PH型（parenchymal hematoma，PH）脑实质出血，定义为梗死区周围有大的血肿[6]。计算各组大鼠各种类型出血的数量[13-14]。

1.2.3 中性粒细胞浸润及蛋白酶激活受体1（protease-activated receptor-1，PAR-1）浓度测量 评价中性粒细胞浸润：脑梗死形成24 h后应用Western blot测定髓过氧化物酶来评价中性粒细胞浸润。脑组织分离后切片成2 mm厚，分离出同侧及对侧MCA范围，组织冷冻用于分析。组织放置在缓冲液中[由50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH=7.6），150 mmol/L氯化钠NaCl，5 mmol/L氯化钙CaCl2，0.05%聚环氧乙烯月桂酰醚，0.02%叠氮化钠NaN3，1%聚乙二醇辛基苯基醚混合而成]，4℃、12 000 r/min离心5 min。在上清液中分离蛋白组织。10%聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶着色。蛋白转到薄膜上，4℃孵化过夜，加抗MPO的鼠单克隆抗体，稀释到1∶500，室温孵化2 h，加鼠二抗，稀释到1∶2 500，加兔多克隆抗体对抗β-微管蛋白（β-tubulin），稀释到1∶10 000。再加过氧化物酶相连的抗兔二抗，抗兔二抗稀释到1∶2 500。免疫组织化学法测定PAR-1。标本置甲醛溶液中固定、包埋。按下述步骤行PAR-1免疫组织化学染色：切片、微波修复抗原、3%过氧化氢抑制、兔血清封闭、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗体）、4℃过夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC、DAB显色，苏木素复染。高倍镜下随机选取左侧海马皮质相邻而不重叠的4个视野区，用图像分析软件计算PAR-1阳性表达细胞数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，直线回归分析评价梗死面积与神经系统损伤评分的关系，方差分析进行多组间比较，若有统计学意义用LSD-t检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

血栓形成后24 h测量各组小鼠校正的梗死面积以及神经系统损伤评分比较，差异有统计学意义，LSD-t检验发现，对照组梗死面积和神经系统损伤评分均较其他组增高，低剂量t-PAm组梗死面积和神经系统损伤评分较t-PAm组有增加，但较t-PA组差异无统计学意义。24 h后小鼠神经系统损伤评分与梗死面积的大小有相关性（r=0.613，P=0.000）。见附表和图1、2。

在梗死外组织未见出血。出血位于梗死血管周围的皮层下、皮层及外周脑组织中。各组出血部位无差异。分析脑出血的类型发现，HI-1和HI-2型的出血较PH型更常见（P＜0.05）。

t-PA组和常规剂量t-PAm组HI-2型出血较对照组有增高，而低剂量t-PAm组HI-2型出血较对照组有增高趋势，但差异无统计学意义。t-PA组和常规剂量t-PAm组间HI-2型脑出血差异无统计学意义，但较低剂量t-PAm组增高。这也表明低剂量t-PAm组在溶解脑梗死的同时HI-2型的脑出血的发生率有减低趋势。

附表 不同治疗方法的梗死面积和神经系统损伤评分的比较 （n=21，x±s）

图1 不同治疗方法的梗死面积对比图

图2 梗死面积和神经系统损伤评分的比较

各处理组中髓过氧化物酶表达不同（F=3.752，P=0.042），而在梗死部位的对侧未见表达，LSD-t检验发现，在爱通立溶栓后会阻止因缺血带来的MPO的升高（t=8.536，P=0.032），应用t-PAm后则更明显阻止MPO的升高（t=12.536，P=0.022）。通过电泳图看到t-PAm能够通过提高再通率及缩短再通的时间来减少中性粒细胞的浸润，从而减轻急性缺血带来的炎症反应。见图3、4。

凝血酶的细胞外效应在脑组织缺血损伤中起重要作用，其细胞外效应由凝血酶受体介导，PAR-1对凝血酶的介导作用最强。本实验可知随着脑动脉血栓形成，每个统计场（0.26 mm2）脑组织PAR-1阳性细胞数升高（F=12.356，P=0.012），经LSD-t检验，与对照组比较，应用t-PA后，PAR-1阳性细胞数继续升高，有统计学意义（t=6.536，P=0.046）。而低剂量t-PAm组局部PAR-1阳性细胞数却有下降趋势（t=8.536，P=0.040），但较t-PA组无显著减低，而t-PAm组PAR-1阳性细胞数较t-PA组有减低（t= 16.536，P=0.016），表明t-PAm对PAR-1生成有抑制作用。见图5。

图3 不同治疗方法电泳图

图4 不同治疗方法MPO相对水平比较

图5 各组PAR-1阳性细胞数比较

3 讨论

急性脑梗死在我国有较高的发生率和较大的危害，早期开通闭死的脑血管，并尽可能地降低再灌注损伤是临床治疗的方向。早期发现、早期诊断、早期应用有效的溶栓物及加强缺血脑组织的保护治疗是临床治疗的基本策略，寻找理想的溶栓剂是永远努力的方向。

为降低t-PA对PAR的敏感性，延长其半衰期从而提高溶栓效果，根据t-PA与PAR的结合特性，贺石汉设计了t-PA与PAR结合部位的定点突变，成功构建了重组质粒pU CT-t-PAm，并表达t-PAm，t-PAm克隆到pFT-his原核表达载体上，诱导表达出的目的蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在于细胞内。在没有PAR存在的体外实验已表明t-PAm活性比t-PA高很多，为减少给药量、提高治疗效果、进一步开发半衰期较长的溶栓药物打下良好的基础[8-9]。

本实验发现，急性脑梗死形成3 h后与对照组及t-PA组相比，t-PAm能减少梗死面积，并不明显提高脑出血的发生率。低剂量t-PAm组与t-PA组有相似的溶栓疗效并有较低的脑出血的发生率，而常规剂量t-PAm较t-PA组的溶栓疗效更佳，且与t-PA组有相似的脑出血的发生率。因此可见，t-PAm的疗效较t-PA更好。同时，梗死面积与神经系统评分有密切的相关性，t-PAm组评分低于对照组。溶栓后出血是常见并发症，在溶栓组HI-2型的出血升高，低剂量t-PAm组与t-PA组比较，HI-2型出血有降低，说明在保证溶栓疗效的同时，新药t-PAm会带来相对较少的出血风险。

脑梗死后及时进行抗凝血酶治疗，有可能抑制PAR-1的高表达，减少氧自由基的生成，从而减轻脑组织炎症反应和脑组织损伤。同时积极减少中性粒细胞的浸润也对脑组织的损伤有预防作用。已有许多药物如S-0139、尿酸、他汀类调脂药等[12-14]也有一定作用。本实验证明t-PAm有较好的抑制中性粒细胞浸润及减低PAR-1表达的作用，表明在溶解血栓再灌注的同时，t-PAm提供很好的脑组织保护作用。

通过本实验证明，新型溶栓物t-PAm对急性脑梗死有良好的溶解作用，同时，脑出血的并发症相对较少，而且能抑制中性粒细胞浸润，降低PAR-1生成，保护脑细胞，为临床应用打下良好基础。

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（张蕾 编辑）

Protective effect of tissue type plasminogen activator mutant on acute cerebral thrombosis and cerebral tissue in rats

Pei-qiu Hou1,Dan Zhu1,Xi Tang2,Chuan Lin3,Da-kui Zeng3
(1.Department of Medical Imaging,Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China; 2.Department of Medical Imaging,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu,Sichuan 610500,China;3.the Second Department of Oncology, the Second People's Hospital of Yibin,Yibin,Sichuan 644000,China)

Objective To evaluate the thrombolytic and brain-protective effect of new tissue plasminogen activator mutant in rat model of acute cerebral thrombosis.Methods Eighty-four adult Wistar rats were randomly divided into control group,tissue-type plasminogen activator(t-PA)group,low-dose tissue plasminogen activator mutant(lowdose t-PAm)group and conventional-dose tissue plasminogen activator mutant(regular-dose t-PAm)group.The rats of the three groups were treated separately 3 hours after thrombosis in middle cerebral artery.Volume of infarction, neurologic scores and severity of hemorrhage were observed 24 hours after treatment.The protective role of t-PAm for brain tissue was evaluated through neutrophil infiltration and the change in the concentration of PAR-1.Results Volume of infarction in the low-dose t-PAm group and the regular-dose t-PAm group was significantly smaller than that in the control group[(108.5±27.3)mm3and(68.3±17.2)mm3vs (323.4±42.3)mm3],and the neurologic scores were evidently correlated with the volume of infarction(r=0.613,P＝0.000),while the incidence of cerebral hemorrhage in the low-dose t-PAm group was not significantly increased.T-PAm also reduced the production of myeloperoxidase,as well as the production of PAR-1,compared with the t-PA group(P＜0.001).Conclusions Newtissue plasminogen activator mutant shows better thrombolytic effect with significant protection for ischemic brain tissue.

urokinase;thrombus;recombinant tissue-type plasminogen activator;mutant

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.005

1005-8982（2017）04-0022-05

2016-04-08

唐曦，Tel：13438105051；E-mail：zz13938972737@163.com