甲基睾酮对雌斑马鱼内分泌干扰效应的研究

侯丽萍，何骏驹，冯子懿，郑 果，梁艺聪，方少彬

（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）

甲基睾酮对雌斑马鱼内分泌干扰效应的研究

侯丽萍，何骏驹，冯子懿，郑 果，梁艺聪，方少彬

（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）

甲基睾酮（MT）广泛存在于造纸废水中，为了研究其对水生动物内分泌的干扰效应，选用斑马鱼为模式生物，开展甲基睾酮对斑马鱼的慢性毒性暴露实验。将雌性斑马鱼分别暴露在含 10、50、100 和 150 μg/L 的甲基睾酮水环境中 48 d，另设空白对照和 0.01% 甲醇对照，观察斑马鱼的个体生长指标及组织结构的变化。结果表明：当 MT 浓度为 150 μg/L 时，斑马鱼全部死亡；而在 0～100 μg/L 的 MT 暴露处理中，随着MT浓度的增加，斑马鱼的体重逐渐减轻，体长逐渐缩短，臀鳍逐渐变大，体色转向偏黄，出现了雄性化的特征；而且肝脏和性腺重量均明显减轻，卵巢出现明显的退化特征，肝细胞逐渐肿大，细胞核偏移中央，且伴随细胞中空等现象；其中，50 和 100 μg/L MT 处理的斑马鱼鳃丝变得高低不一，有的开始断裂甚至结构无法辨认。

斑马鱼；环境激素；甲基睾酮；毒理作用

近年来，随市场需求的不断增长，激素因见效快、辐射广、周期短及获取途径多等优点在养殖业被广泛使用。某些商家为了快速牟利，便将激素混入饲料中喂养畜禽，让畜禽畸形生长，使其适应市场需求。这种做法不仅会使牲畜内分泌系统失调，各器官出现畸形化病变，残留的激素还可能流入周围环境祸害当地的其他动物，破坏生态平衡。在激素使用中，环境激素的使用最为广泛。

环境激素又称内分泌干扰物（Endocrine disruptors chemicals，EDCs），因分子结构与天然荷尔蒙相似，故易与激素受体结合，影响动物内分泌系统，导致动物多种机能如生育和神经机能不能正常运作[1-2]。其中运用最多的就是雄性激素。

雄激素能将雌性动物雄性化，使其拥有部分雄性动物的体征，在养殖水环境中添加一定量的雄激素如雄 烯 二 酮（4-androstene-3,17-dine，ADSD） 或 甲 基 睾酮（17 a-methyltestosterone，MT）可使雌鱼肉质更紧凑，鱼类生长速度加快，生长周期缩短，但其会损害鱼类如日本鳗鲡和剑尾鱼等水生动物的器官功能，并影响激素正常分泌，导致肝脏和性腺等出现病变[3-5]，甚至死亡。而死亡个体又会分泌出环境激素继续污染环境，毒害其他水生动物，影响自然状态下物种的性别比例。各国对环境激素风险评估结果表明，环境激素对各脊椎动物长期侵染有巨大危害[6]，但不同浓度甲基睾酮对鱼类的影响并非呈绝对正相关或负相关[7-8]。

雄激素中 17 α- 甲基睾酮（MT）一般由人工合成，因其合成简单、效果明显，被广泛用于各个领域。MT能促进日本鳗鲡、罗非鱼及鲫鱼生长，还可让雌性的鱼雄性化，产生精子[9]，甚至可使雌性赤点石斑变成功能性雄鱼与雌鱼交配[10]。但在各国的风险评估报告中，MT对人类危害的评估几乎为空白。因此，以基因与人类相似性达 85% 的斑马鱼[11]为材料，利用不同浓度 MT 进行为期 48 d 的暴露试验，观察斑马鱼的各项生长指标和组织结构的变化，进而分析判断MT对斑马鱼的病理学作用，由此推断MT对人类生理的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以基因与人类相似性达 85% 的斑马鱼[11]为材料（购自芳村花鸟鱼市场），体长均为 4～5 cm，体重均为 0.7～0.9 g，鱼龄相当于成体斑马鱼，以红虫为饵料。在实验室驯养至不再出现死亡个体则开始暴露试验。

试验主要试剂有甲基睾酮、0.01% 甲醇、70% 乙醇、Bouin 氏液等。暴露容器为 25 cm×20 cm×20 cm的方形玻璃缸。

1.2 试验方法

1.2.1 MT 暴露处理 MT 溶液设置 4 个浓度，分别为 10、50、100 和 150 μg/L，另设空白对照（CK1）与 0.01%甲醇对照（CK2）。每个处理放入 30 条鱼龄相当、大小相似的雌性斑马鱼。连续暴露 48 d，期间每隔 24 h换水一次，每次换总水量的 1/3。

1.2.2 形态学实验数据采集 暴露 48 d 后斑马鱼深埋冰里致死，记录鱼的长度及体重，把臀鳍切下在解剖镜下观察臀鳍数。

1.2.3 组织切片制作 斑马鱼冰处死后，取出其腮、肝、性腺，用 Bouin 液、乙醇、二甲苯等制作石蜡切片，切片进行EH染色。

1.3 数据处理与分析

试 验数据采 用 SPSS 软 件进行 分 析，并 用单因素方差分析（ANOVA） 来检验不同浓度组斑马鱼各生理指标的差异，用 LSD 对结果进行验后多重比较。P<0.05，则认为有显著性统计意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度甲基睾酮暴露对雌斑马鱼生长发育的影响

试验结果显示，不同浓度的MT暴露处理，对斑马鱼均产生了一定毒性作用，其中，150 μg/L 的处理斑马鱼全部死亡。由图 1～ 图6 可知，经过 48 d 的MT 暴露，在 0～100 μg/L 浓度范围内，斑马鱼的身长、臀鳍条数、鳃重、肝脏重及性腺重的数值均随浓度的升高而减少，但并未表现出显著性变化；而鱼体重在10、50 和 100 μg/L 的 MT 暴露 下 表 现出极显著减少（P<0.01）。总的来说，斑马鱼随着甲基睾酮浓度增加，体重、体长逐渐减低，外观上臀鳍变大，体色逐渐偏黄，出现雄性化特征。

2.2 不同浓度甲基睾酮暴露对雌斑马鱼组织细胞的影响

图1 甲基睾酮暴露对雌斑马鱼体长的影响

图2 甲基睾酮暴露对雌斑马鱼体重的影响[（图中 ** 表示各处理与对照差异达极显著水平（P ＜ 0.01）]

图3 甲基睾酮暴露对雌斑马鱼臀鳍条数的影响

图4 甲基睾酮暴露对雌斑马鱼鳃重的影响

图5 甲基睾酮暴露对雌斑马鱼肝重的影响

图6 甲基睾酮暴露对雌斑马鱼性腺重的影响

2.2.1 性腺组织切片观察 如图 7A 和 B 所示，空白对照和甲醇对照处理的斑马鱼，卵巢表现正常，卵母细胞间排列紧密，包含了5个时期卵母细胞，成熟卵母细胞丰富 ；10 μg/L 甲基睾酮暴露处理后，斑马鱼卵巢中Ⅲ期以上成熟卵母细胞数目减少（图 7C），50 μg/L 处理组卵母细胞之间排列开始出现明显松散现象，成熟卵期的卵母细胞发生了变形肿胀，出现了退化的卵母细胞（图 7D）；100 μg/L 处理组中卵母细胞排列松散，细胞变形严重，表明卵母细胞退化加重，图中Ⅱ、Ⅲ期细胞占大多数，基本没有Ⅴ期成熟的卵母细胞（图 7E）。

2.2.2 肝组织切片观察 如图8 F 和 G 所示，空白对照与甲醇对照处理的斑马鱼，肝细胞紧密排列，细胞清晰胞质均匀，细胞核于细胞中心，细胞相对较小；10 μg/L 甲基睾酮暴露处理后，斑马鱼肝细胞肿大，细胞核偏移中央，细胞出现中空现象，细胞脂质化逐

渐加深（图 8H）；50 和 100 μg/L 处理组，肝细胞的空泡结构尤为严重，出现核固缩现象，细胞肿大较严重（图8 I、J）。

2.2.3 鳃丝切片观察 如图 9K、L 所示，空白对照与甲醇对照处理的斑马鱼，鳃丝排列整齐紧密，均匀细长 ；10 μg/L 甲基睾酮暴露处理后，斑马鱼腮丝排列变得松散且高低不一（图 9N）；随着甲基睾酮浓度的升高，鳃丝结构退化越来越严重，50 μg/L 处理的腮丝出现断裂，排列非常不整齐，腮丝变得粗短，结构开始模糊（图 9M）；100 μg/L 处理的鳃丝结构退化尤为严重，很多部分已无法辨认（图 9O）。

3 讨 论

图7 不同浓度甲基睾酮暴露 48 d 后雌斑马鱼卵巢组织的变化（A：空白对照，正常卵巢；B：甲醇对照，卵巢无明显变化；C：10 μg/L 处理，卵巢中成熟卵母细胞数目减少；D：50 μg/L 处理，卵巢细胞排列疏松；E：100 μg/L处理，卵巢中Ⅱ、Ⅲ期细胞占绝大多数）

图8 不同浓度甲基睾酮暴露 48 d 后雌斑马鱼肝脏组织的变化（F：空白对照，正常肝脏细胞；G：甲醇对照；H：10 μg/L 处理，肝脏细胞出现肿大；I：50 μg/L 处理；J：100 μg/L 处理，空泡结构严重，出现核固缩）

图9 不同浓度甲基睾酮暴露 48 d 后雌斑马鱼鳃组织的变化（K：空白对照，正常鳃丝结构；L：甲醇对照；N：10 μg/L 处理，鳃丝结构排列松散；M：50 μg/L 处理，鳃丝结构排列不整齐，鳃丝粗短；O：100 μg/L 处理，鳃丝结构部分已无法辨认）

参考前人[12-13]的方法，对斑马鱼各指标间的相关性进行线性回归分析，结果显示，在试验选取的MT 浓度范围中，10 和 50 μg/L 的 MT 浓度处理，斑马鱼的体重发生了显著性变化，而其他试验指标在各浓度处理的差异均未达到显著性水平。综合切片分析，造成这一结果的原因有二：一是试验所采取的MT最低浓度已超出显著性变化范围，所以更高浓度对斑马鱼除体重指标外的其他指标的影响升幅不明显；二是此次试验MT最高浓度没达到显著性变化浓度。因此，仍需扩大试验浓度范围或缩小浓度区间作进一步研究。

试验中，随着MT浓度的增加，斑马鱼的体重逐渐减轻，体长逐渐缩短，臀鳍逐渐变大，体色转向偏黄，出现了雄性化的特征。尤其是在高浓度MT作用下，雄性化特征逐渐明显。石蜡切片观察显示，随着MT浓度的增加，斑马鱼的肝脏、性腺和腮的重量均明显减轻，且卵巢出现明显的退化特征。这与赵春刚等[14]的研究结果相似；肝细胞逐渐肿大，细胞核偏移中央，且伴随细胞中空、细胞脂质化加深等现象；其中，50和 100 μg/L MT 处理的斑马鱼鳃丝变得高低不一，有的开始断裂甚至结构无法辨认。

研究表明，甲基睾酮对鱼类转雄效应较显著，其中包括鲑点石斑鱼[15]、黄腹石斑鱼[16]等多种石斑鱼，食蚊鱼[17]和剑尾鱼。该试验也证实了外源激素甲基睾酮的长期暴露可使雌鱼斑马鱼趋向雄性化发育，而且多种器官出现病理性损害。因此，加强对环境中外源性激素的评估及其对人类等哺乳动物影响的研究十分必要。

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（责任编辑：成 平）

Endocrine Disruption of Methyltestosterone on Zebra Fish

HOU Li-ping，HE Jun-ju，FENG Zi-yi，ZHENG Guo，LIANG Yi-cong，FANG Shao-bin
（School of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, PRC）

Methyltestosterone is widely present in papermaking wastewater drainage. In order to study endocrine disrupting effects it produces, this paper used zebra fi sh as model organism to conduct methyltestosterone zebra fi sh exposed to chronic toxicity experiments. The female Zebra fi sh were exposed to the water environment with 0, 10, 50, 100 and 150 μg/L methyl testosterone in 48 days and no MT group and 0.01% methanol group used as control group, to record their growth indicators changes and tissue damaged. The results showed that exposure to 150 μg/L MT Zebra fi sh all died. In other groups, with the growth of concentration, various indicators have been changed. MT has tiggered some symptoms to treated group zebra fi sh, such as oval cells degenerated; hepatocyte tumefaction, vacuolation and nuclear offseted. Besides that, in 50 and 100μg/L MT groups, fish fin filgaments showed uneven, some of them even broken or unrecognized.

Zebra fi sh; environmental hormone; methyl testosterone; toxicological effects

S917.4

A

1006-060X（2017）03-0070-04

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.020

2016-09-26

汕头大学开放基金（GPKLMB201603）

侯丽萍（1977-），女，广东乐昌县人，讲师，主要从事生态毒理学研究。