龙牙百合种球鳞片无菌快繁技术研究

肖 珂，王梦希，胡胜男，彭国平

（1.湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学院，湖南 长沙 410128）

龙牙百合种球鳞片无菌快繁技术研究

肖 珂1，王梦希1，胡胜男1，彭国平2

（1.湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学院，湖南 长沙 410128）

以龙牙百合鳞片为材料，对其组织培养中的关键技术进行了研究。结果表明：百合鳞片组织培养最适表面消毒方法为 75% 乙醇擦洗 3 min+0.1% 氯化汞浸泡 13 min；最佳诱导培养基配方为 MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L；最佳扩繁培养基配方为 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；最佳生根培养基配方为 1/2MS+NAA 0.10 mg/L。

龙牙百合；鳞片；消毒灭菌；组织培养

龙牙百合 L.brownii（F.E.Brown ex Mille）var.viridulum Baker是百合的优良品种，产量高、品质好，因鳞片片形似龙牙而得名，是市场上最受欢迎的百合商品之一。实际生产中，龙牙百合病害极为严重，常引起大面积、规模性的死苗，导致减产甚至无收[1]。百合病害爆发的原因主要有 ：（1）百合长期进行无性繁殖，病菌通过种球代代相传 ；（2）百合同时受土传病害、空气传播病害、昆虫传播病害的危害，病害种类多，侵染严重。笔者通过组培技术，去除种球所带的病原微生物，获得无病毒、无细菌、无真菌的种球，以期为龙牙百合安全生产和农户效益提高提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料及试剂 供试材料为新鲜龙牙百合，来自怀化市中方县泸阳镇龙牙百合生产基地，从沙床中取出新鲜龙牙百合，去除部分染病的百合鳞片后洗净平摊开，待其表面水珠沥干后备用。供试试剂有无水乙醇（分析纯）、氯化汞（分析纯）、84 消毒液、MS 干粉、蔗糖（分析纯）、琼脂粉、6-苄氨基嘌呤（分析纯）、萘乙酸（分析纯）。

1.1.2 仪器设备 FA2104N 型电子天平（上海菁海仪器有限公司）、洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、高压灭菌器（德国 DAIHAN Sdentifi c 有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 消 毒 按表1 的方案分别进行消毒处理，消毒后百合鳞片用蒸馏水清洗 3 次 ；将鳞片切成 1 cm2左右的小片，接入MS培养基中，每个处理接种20块小片（下同）[2]，观察记录百合鳞片的生长状态。

1.2.2 愈伤组织诱导培养基的优化 为诱导百合鳞片形成愈伤组织，在 MS 培养基中加入 6-BA、2,4-D 两种激素，为确定诱导百合鳞片的最适激素浓度，设置6 个不同浓度梯度（表 2）[3]，观察记录培养基中百合鳞片的生长状态。

1.2.3 小鳞球增殖培养基的优化 在小鳞球增殖培养基（MS 培养基）中同时使用 6-BA、NAA 两种激素，能较好的促使百合小种球增殖[4-5]。为研究百合小种球鳞茎生长的最适激素浓度，设置了5种不同浓度梯度（表 3），观察记录培养基中小鳞球的生长状态。

表1 百合鳞片消毒方案

表2 愈伤组织诱导培养基激素浓度设计

表3 小鳞球的增殖培养基激素浓度

1.2.4 小鳞球生根培养基的优化 在小鳞球增殖培养基中添加激素 NAA，能较好地促使百合小种球生根[4-5]。为研究百合小种球鳞茎生根的最适激素浓度，分别在1/2MS 培 养 基 中 添 加 0.03、0.06、0.10、0.13 和 0.16 mg/L 的 NAA，观察记录小鳞球的生根状态。

2 结果与分析

2.1 消毒试剂对百合鳞片组织培养的影响

从表4中可以看出，单独使用一种消毒剂消毒，灭菌效果都不理想，处理 1～6 的杂菌感染率都在 40%及以上，且诱导出芽的块数较少，仅 10～17个，这表明氯化汞和84消毒液单独作为消毒剂时，控菌能力较差，且在试验设计的处理时间内对百合鳞片有较大的伤害。而采用 75% 乙醇 + 氯化汞的消毒处理，能有效控制培养过程中杂菌生长，处理 7～15的杂菌感染率均不超过 10%，最低可至 3% ；但是如果处理时间过长，也会对百合鳞片造成伤害，如处理 14～15 的发芽数显著低于处理 7～13。综合考虑，百合鳞片组织培养的最适消毒方法为 ：75% 乙醇擦洗 3min+0.1%氯化汞浸泡 13 min（处理 10），其杂菌感染率为 5%，发芽率可达 100%。

2.2 培养基优化结构

表4 不同消毒处理对百合鳞片组织培养的影响

2.2.1 诱导培养基 由表5 可知，添加 6-BA 和 2,4-D后愈伤组织诱导率达 100%。当 6-BA 添加浓度为 0.2 mg/L 时，愈伤组织数随着 2,4-D 浓度的增加而上升 ；而当 6-BA 添加浓度为 0.4 mg/L 时，愈伤组织数随着2,4-D 浓度的增加而下降。其中，以 MS+6-BA 0.2 mg/ L+2,4-D 2.0 mg/L 的激素水平，百合鳞片的愈伤组织诱导率达 100%，且愈伤组织个数最多。

表5 不同激素水平下百合鳞片愈伤组织诱导情况的比较

2.2.2 增殖培养基 由表6 可知，5 个浓度梯度中，以浓度梯度3的百合小鳞球增殖最多，增值率为100%。故增殖培养基中的最适激素浓度为 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.5 mg/L。

表6 不同激素水平下百合小鳞球增殖情况的比较

2.2.3 生根培养基 由表7 可知，添加 NAA 后，生根率达 100%。当 NAA 浓度过低或过高时，诱导产生不定根的效率都不高，当 NAA 浓度为 0.10 mg/L 时，不定根数量达到峰值，单株生根数达 5.4 根。故生根培养基中 NAA 的最适添加浓度为 0.10 mg/L。

表7 不同激素水平下百合小鳞球生根情况的比较

3 结论与讨论

外植体进行组织培养前，必须经过消毒处理，而消毒试剂的选择和消毒时间的控制均会影响愈伤组织的诱导。由于外植体结构和属性不同，各种材料对消毒试剂都有不同反应。例如石云平等[6]以顶芽和叶片为外植体时，用 10% 漂白粉溶液处理 10 min 进行消毒。还有研究，用浓度为 20.0 g/L 的次氯酸钠溶液浸泡 10 min，灭菌时不断摇动进行外植体消毒。对百合鳞片来讲，消毒剂的浓度不能过高，处理时间也不能过长。试验分别采用了氯化汞浸泡法、84消毒液浸泡法、乙醇擦洗+氯化汞浸泡法进行消毒试验，确定了龙牙百合鳞片组织培养前最适消毒方法为 75% 乙醇擦洗 3 min+0.1% 氯化汞浸泡 13 min，其杂菌感染率为 5%，发芽率可达 100.00%。采用该方法诱导出的愈伤组织不用进一步消毒，可直接进行继代培养。

在龙牙百合的组织培养过程中，各阶段的培养基所用激素水平不同。在实际生产中，组培苗生长发育的每个阶段选取最适培养基配方，可以使效益最大化[7]。试验结果表明，诱导百合鳞片愈伤组织的最佳培养基配方为 MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。在小鳞球的增殖培养基中同时使用 6-BA、NAA 2 种激素，能较好地促使百合小鳞球增殖，但要注意2种激素的浓度平衡，如果某种激素浓度过高会适得其反，甚至使小鳞球死亡，浓度过低又会导致百合小鳞球无法扩增。该试验得出百合小鳞球增殖扩繁的最佳培养基配方为MS+ 6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L。NAA 是促进植物根系生长的植物生长调节剂，但不同植物生根所需的浓度不一致，试验结果表明百合小鳞球生根培养的最佳培养基配方为 ：1/2 MS + NAA 0.1 mg/L。

[1]蒋细旺，司怀军 . 百合的组织培养技术综述 [J]. 湖北农业科学，2004，（1）：78-82.

[2]陈世昌，徐明辉 . 植物组织培养 [M]. 重庆 ：重庆大学出版社，2016.

[3]杨柏云，杨慧琴，蔡奇英，等 . 龙牙百合体细胞胚的诱导及植株再生 [J]. 南昌大学学报（理科版），2005，（6）：536-539.

[4]刘清波，廖兵辉，蒋建雄，等 . 龙牙百合鳞球增重及生根培养研究 [J].湖南农业大学学报（自然科学版），2006，（4）：375-377.

[5]石云平，杨美纯，李 锋 . 龙牙百合生根·结鳞茎培养基的优化 [J].安徽农业科学，2010，38（32）：18121-18125.

[6]石 云 平 . 龙 牙 百 合 组 织 培 养 的 优 化 研 究 [D]. 广 西 ：广 西 大 学，2008.

[7]金亚征，俞凤芳，车瑞香，等 . 药用百合组织培养快繁技术研究 [J].经济林研究，2013，31（1）：145-148.

（责任编辑：成 平）

Rapid Propagation Technology of Aseptic Longya Lilium Bulb Scales

XIAO Ke1，WANG Meng-xi1，HU Sheng-nan1，PENG Guo-ping2
（1. College of Oriental Institute of Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking Longya lilium bulb scales as materials, the key technique of tissue culture were studied. The result showed that the best disinfection method is scrub it with ethanol of 75% then steeped in mercuric chloride of 0.1 percent. When culture the Longya lily, optimize culture medium in each stage, there come to a conclusion that the culture medium of inducing callus of bulb scales is MS + 2,4-D 2mg/L+ 6BA 0.2mg/L, the culture medium of bulb rapid propagation is MS + BA0.5mg/L + NAA 0.5mg/L, the culture medium of take roots is 1/2MS + NAA 0.1mg/L.

Longya lilium; bulb scales; sterilization; tissue culture

Q945.52

A

1006-060X（2017）03-0007-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.003

2016-12-19

湖南农业大学东方科技学院大学生研究性学习和创新性实验计划项目（DFCXY201455）

肖 珂（1996-），女，湖南隆回县人，本科生，专业生物技术。