香芹酚和丁香酚对杨梅致病菌的抑菌作用

王双辉，罗 林，罗丽娟，陈玲琳，金晨钟

（1.湖南人文科技学院农药无害化应用重点实验室，湖南 娄底 417000；2.湖南省农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000；3.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南 娄底 417000）

香芹酚和丁香酚对杨梅致病菌的抑菌作用

王双辉1,2,3，罗 林3，罗丽娟3，陈玲琳3，金晨钟1,2,3

（1.湖南人文科技学院农药无害化应用重点实验室，湖南 娄底 417000；2.湖南省农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000；3.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南 娄底 417000）

试验以香芹酚和丁香酚为原料，探讨了不同浓度的植物精油对杨梅的保鲜效果；并从腐烂的杨梅中分离出杨梅致病菌，研究了植物精油对杨梅致病菌的抑菌效果；同时，以纳米醇质体为载体，制备植物精油新型纳米防腐剂，考察其是否可以增强植物精油的抑菌效果。结果表明：16‰的香芹酚和丁香酚都能有效降低杨梅的腐烂指数，且香芹酚对杨梅的保鲜效果优于丁香酚；4 株杨梅致病菌对 8% 的香芹酚和丁香酚都表现为极度敏感，且香芹酚对杨梅致病菌的抑菌效果优于丁香酚；香芹酚-纳米醇质体对3株杨梅致病菌的抑菌活性强于同浓度的香芹酚。

植物精油；杨梅致病菌；香芹酚；丁香酚；抑菌

杨梅为我国南方的特产水果，年产量约 80万～100 万 t［1］。杨梅果实颜色鲜艳、香气宜人、味道可口，是一种色香味俱全的水果，深受人们的喜爱。杨梅果实无表皮，易受到机械损伤，而且其成熟期正是梅雨季节，容易感染致病菌，因而储藏期极短。生产中为了延长其储藏时间，常使用化学药剂进行保鲜。目前，常用的杨梅防腐保鲜剂有山梨酸钾、庶糖酯、苯甲酸纳、1- 甲基环丙烯和尼泊金乙酯等［2-4］。这些化学保鲜剂虽然可以延长杨梅的储藏时间，但容易导致环境污染、生态系统破坏和对人畜毒害等问题［5］，已不再适应市场需求。因此，寻找安全高效的保鲜剂显得十分重要［6］。

香芹酚和丁香酚是两种常见的植物精油，分别散发出麝香草酚味和丁香味，能够赋予食品香气，矫正其异味，是一类食用安全的天然香料。同时，这2种物质常温下易挥发，有一定的抗菌生物活性，在果蔬防腐保鲜方面具有较好的应用前景［7-8］。纳米醇质体是一种特殊结构的纳米粒［9］，具有独特的表面效应和量子尺寸效应［10］，可以负载抗菌功能成分，形成一种新型纳米防腐剂。试验以香芹酚和丁香酚为原料，探讨了不同浓度的植物精油对杨梅的保鲜效果，同时以纳米醇质体为载体，制备植物精油新型纳米防腐剂，考察其对杨梅致病菌的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜杨梅，购自湖南娄底农联杨梅基地；香芹酚、丁香酚，购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

主要仪器有 ：Biosafer 250-88 超声波细胞破碎仪（赛飞有限公司）；ZCL型数显智能控湿磁为揽拌器；超净台 ；MIR-2W 恒温培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度精油对杨梅的浸泡保鲜试验 将新鲜完整、无损伤饱满的杨梅分为若干组，每组 500 g，分别在 0、1‰、2‰、4‰、8‰和 16‰的精油溶液中浸泡 5 min，沥干，放入塑料筐内，内衬厚度为0.04 mm 的聚乙烯塑料，保鲜膜封口保温，放置于20～25℃室温下，8 d 后统计腐烂级别 I（I=0～3，判定标准［11］见表 1）以及各级别的果实数 NI，计算腐烂指数。腐烂指数 =∑（I×NI）/3×∑NI。

表1 腐烂级别判定标准

1.2.2 杨梅致病菌的分离与纯化 在超净台中使用75% 的乙醇对所取腐烂杨梅表面消毒 4～5 min，用已灭菌小刀切取 5 mm 的腐烂组织小块，无菌水冲洗切下的组织小块 2～3 次，无菌滤纸擦干 ；将腐烂组织小块放入 PDA 平板中［12］，28℃培养 3～5 d 至组织周围长出菌落 ；选取杨梅组织附近的菌接种到新的 PDA培养基上，进一步纯化直至产生单一菌落。将分离纯化的菌种回接到新鲜的杨梅果实上，如发病症状与贮藏时的腐败症状一致，即可作为杨梅致病菌［13］。

1.2.3 不同浓度精油对杨梅致病菌抑菌效果试验 采用纸片扩散法［14］测定 1%、2%、4% 和 8% 的精油对杨梅致病菌的抑菌活性，抑菌活性判定标准［15］见表 2。

表2 抑菌活性判定标准

1.2.4 植物精油 -纳米醇质体的制备及抑菌效果 选用抑菌效果较好的香芹酚作为研究对象，将其制备成香芹酚浓度为 8% 的纳米醇质体，考察香芹酚 -纳米醇质体的抑菌活性，以普通的8%香芹酚精油为对照。纳米醇质体的制备过程 ：在锥形瓶中先后加入 15 mL乙醇、0.1 g 磷脂、0.01 g 乳化剂 -K、0.1 mL 吐温 -80、0.1 g 精油，将其置于磁力搅拌器中混合共溶，30℃水浴和 1 000 r/min 的转速下持续搅拌 2 min，密闭状态注射器缓慢滴加纯净水 35 mL，再继续搅拌 5 min，转入 50 mL 离心管，冰浴下用超声波细胞破碎仪探头超声 2 min（频率为 5 s/次，开 4 s，停 1 s），即可获得精油纳米醇质体［16］，4℃保存备用。

2 结果与分析

2.1 精油浓度对杨梅腐烂指数的影响

由图1所知，随着植物精油浓度的升高，杨梅腐烂指数不断降低 ；贮藏 8 d 后，空白组腐烂指数达到97.1%， 而 16‰ 香 芹 酚 处 理 组 腐 烂 指 数 仅 为 40.1%，16‰丁香酚处理组腐烂指数为 57.3%。由此可知，植物精油浸泡处理可以有效降低杨梅的腐烂程度，并且香芹酚的保险效果优于丁香酚。

图1 精油浓度对杨梅腐烂指数的影响

2.2 杨梅致病菌的分离与纯化

按照常规的组织分离法从腐烂的杨梅果实内分离出 4 株杨梅致病菌，将其分别命名为 LLC-1、LLC-2、LLC-3、LLC-4。各菌菌落形态特征如下 ：LLC-1 号菌为霉菌，呈乳白色，菌中间有突起点，表面粗糙，形状不规则，边缘为白色，从中心点向四周呈放射性的丝状 ；LLC-2 号菌为霉菌，呈淡乳黄色，中间有明显突起，菌丝从中心点向四周呈放射性的丝状，绒毛状；LLC-3 号菌为革兰氏阴性菌，呈淡淡黄褐色，个体较小，扁圆形，表面光滑 ；LLC-4 号菌为酵母菌，呈乳黄色，菌落个体大而厚，表面光滑、湿润、粘稠。

2.3 精油浓度对杨梅致病菌抑菌效果的影响

由表3可知，不同浓度的香芹酚和丁香酚对4株杨梅致病菌都有一定的抑制效果，抑菌圈的大小因植物精油种类、浓度和菌株而异。精油浓度越大，抑菌圈越大，抑菌活性越强，1% 和 2% 的香芹酚对 LLC-2、LLC-3、LLC-4 表现为中度敏感，对 LLC-1 为低度敏感 ；4% 的香芹酚对 LLC-1 和 LLC-2 为中度敏感，对 LLC-3 和 LLC-4 为高度敏感 ；8% 的香芹酚对 4 株菌都表现为极度敏感，抑菌圈大小都超过 30 mm。1%的 丁 香 酚 对 LLC-1、LLC-4 中 度 敏 感， 对 LLC-2 和LLC-3 为高度敏感 ；2% 的丁 香 酚 对 LLC-1、LLC-3、LLC-4 高度敏感，对 LLC-2 为极度敏感 ；4% 的丁香酚对 LLC-1 为高度敏感，对 LLC-2、LLC-3 和 LLC-4为极度敏感；8%的丁香酚对4株菌都表现为极度敏感。综上所述，香芹酚和丁香酚对4株杨梅致病菌都有非常好的抑菌效果，且香芹酚抑菌效果优于丁香酚。

表3 不同浓度精油处理杨梅致病菌抑菌圈大小的比较

2.4 植物精油 - 纳米醇质体对杨梅致病菌的抑菌效果

如表4 所示，8% 的香芹酚 -纳米醇质体对杨梅致病菌 LLC-1、LLC-3 和 LLC-4 的抑菌活性比同浓度的香芹酚有所增强，抑菌圈分别增大了 5.07、4.54、4.68 mm ；而 8% 的香芹酚 - 纳米醇质体对杨梅致病菌LLC-2 的抑菌活性比同浓度的香芹酚有所减弱，抑菌圈缩小了 7.85 mm。

表4 香芹酚 -纳米醇质体对杨梅致病菌的抑菌效果

3 结 论

以香芹酚和丁香酚两种常见的植物精油为材料，研究了不同浓度精油浸泡处理对杨梅的保鲜效果，结果表明：两种植物精油都能够有效降低杨梅的腐烂率，且浓度越高，保鲜效果越好 ；贮藏 8 d 后，空白组腐烂指数达到 97.1%，而 16‰香芹酚和 16‰丁香酚处理组的腐烂指数分别为 40.1% 和 57.3%，比空白组降低了 57 和 39.8 个百分点。试验从腐烂杨梅果实中分离纯化出 4 株杨梅致病菌，其中，LLC-1 和 LLC-2 为霉菌，LLC-3 为细菌，LLC-4 为酵母菌。利用纸片扩散法研究了不同浓度香芹酚和丁香酚对4株杨梅致病菌的抑菌效果。结果表明，香芹酚和丁香酚对4株杨梅致病菌都有非常好的抑菌效果，当浓度为 8%时，对4株菌株均表现为极度敏感，且香芹酚的抑菌效果优于丁香酚。

另外，试验还探讨了香芹酚-纳米醇质体对杨梅致病菌的的抑菌效果。结果表明，与同浓度的香芹酚相比，8% 的香芹酚 -纳米醇质体对杨梅致病菌 LLC-1、LLC-3 和 LLC-4 的抑菌圈分别增大了 5.07、4.54、4.68 mm，而对杨梅致病菌 LLC-2 的抑菌圈缩小了 7.85 mm，其原因有待进一步研究。

［1］ 谢焕雄，王海鸥，胡志超，等 . 我国杨梅生产与贮藏加工现状 ［J］.食品研究与开发，2007，128（6）：124-126.

［2］ 柴春燕，陈利江，江建远 . 喷洒 CAP-10 等防腐剂对杨梅保鲜试验［J］. 上海农业科技，1999，（4）：76-79.

［3］ 王益光，林美士 . 杨梅化学防腐保鲜试验初报 ［J］. 中国南方果树，2002，（31）：26.

［4］ 茅林春，方雪花，庞华卿 . 1-MCP 对杨梅果实采后生理和品质的影响 ［J］. 中国农业科学，2004，37（10）：1532-1536.

［5］ Bouwmeester H，Dekkers M Y，Noordam W I，et al. Toxicol［J］. Pharmacol，2009，53 ：52-62.

［6］ 巩卫琪 . 香芹酚 -β- 环糊精包合物的制备及对杨梅果实的缓释保鲜研究 ［D］. 南京 ：南京农业大学，2010.

［7］ Sivakumar D，Bautista-Banos S. Areview on the use of essential oils for postharvest decay control and maintenance of fruit quality during storage［J］. Crop Protection，2014，64 ：27-37.

［8］ 吴 新 . 植物精油对草莓和杨梅果实保鲜的作用及机理研究 ［D］.合肥 ：安徽农业大学，2014.

［9］ Touitou E，Godin B，Weiss C. Enhanced delivery of drugs into and across the skin by ethosomal carriers［J］. Drug Development Research，2000，50 ：406-415.

［10］ Jiang W，Kim B Y S，Rutka J T，et al. Nanoparticle mediated cellular response is size-dependent［J］. Nature Nanotechnology，2008，3 ：145-150.

［11］ Chen H J，Yang H，Gao H Y，et al. Effect of hypobaric storage on quality，antioxidant enzyme and antioxidant capability of the Chinese bayberry fruits［J］. Chemistry Central Journal，2013，7（1）：4-5.

［12］ 张 玲 . 微 生 物学实 验 指 导 ［M］. 北 京 ：清 华 大 学出版 社，2010. 18-19.

［13］ 方 中 达 . 植病研究方法（第 S 版）［M］. 北 京 ：中 国 农业出版社，1998. 113-115.

［14］ 周帮靖 . 常用中药的抑菌作用及其测定方法 ［M］. 重庆 ：科技文献出版社重庆分社，1987. 289-231.

［15］ 蔡一鸣，任荣清，文正常 . 中药方剂的抑菌试验 ［J］. 贵州畜牧兽医，1995，19（4）：4-5.

［16］ 刘 红 . EGCG 纳米醇 质 体 的制备及其抗紫 外 辐 射增效研究 ［D］.杭州 ：浙江工商大学，2015.

（责任编辑：成 平）

Inhibition Effects of Carvacrol and Eugenol on Bayberry Pathogens

WANG Shuang-Hui1,2,3，LUO Lin3，LUO Li-juan3，CHEN Ling-lin3，JIN Chen-zhong1,2,3
（1. Key Laboratory of Pesticide Hurmless Application, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC; 2. Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Field Weeds Control, Loudi 417000, PRC; 3. College of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, PRC）

Carvacrol and eugenol, two plant essential oils, are used to study the preservation effect of red bayberry, and bayberry pathogens are isolated from rotten red bayberry, then the effect of plant essential oil on the inhibition of bayberry pathogens is studied. Meanwhile, the plant essential oils are prepared into nano-ethosomes, to explore whether it could enhance the antibacterial effect of plant essential oils. The results showed that 16‰ carvacrol and eugenol effectively reduce the decay index of bayberry, and preservation effect of carvacrol is better than that of eugenol, four bayberry pathogens are extremely sensitive to 8% carvacrol and eugenol, and the antibacterial effect of carvacrol is better than that of eugenol. In addition, the antimicrobial activity of carvacrol nano-ethosome on three strains is better than that of the same concentration of carvacrol.

plant essential oil; bayberry pathogen; carvacrol; eugenol; bacteriostasis

S482.2+95

A

1006-060X（2017）03-0063-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.018

2016-12-29

湖南省教育厅科技计划项目（2017-1114）；湖南人文科技学院青年基金项目（2015QN10）；湖南省高校创新平台开放基金（15K066）作者简介：王双辉（1985-），男，湖南双峰县人，助教，主要从事食品微生物与天然产物利用研究。

金晨钟