柠檬自交后代抗柑橘溃疡病的离体鉴定

谭李梅，刘 慧，朱志媚，周 东，汤 甜，邓子牛

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410128）

柠檬自交后代抗柑橘溃疡病的离体鉴定

谭李梅1,2，刘 慧1，朱志媚1,2，周 东1，汤 甜1，邓子牛1,2

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心长沙分中心，湖南 长沙 410128）

为鉴定柠檬自交后代对柑橘溃疡病的抗性，以柠檬鲜叶为材料，通过注射法和针刺法接种不同浓度溃疡病菌菌液，对 114 株柠檬自交后代群体进行离体鉴定，并以感病材料冰糖橙、抗病材料枸橼 C-05 作为对照。结果表明：柠檬自交后代对溃疡病抗性存在个体间差异；其中，注射接种法中表现为抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株有 24 株，针刺接种法中表现为抗 108CFU/mL 病原菌的植株有 11 株；其中，有 6 株柠檬自交后代在2种鉴定方法中均被认定为抗病株。综合2种鉴定方法，114 株柠檬自交后代中有 29 株对溃疡病表现出抗 104CFU/mL 病原菌。

溃疡病；柠檬自交后代；离体接种；抗性评价

柑橘溃疡病是由柑橘黄单孢杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri） 引 起 的 一 种 细 菌 性 病害，对柑橘产业危害严重，世界许多国家将其列为重要检疫性病害[1-2]。多数柑橘枝叶及果实感病后都会出现典型的火山口状病斑，严重影响其树势和产量[3-4]。感病果实的外观也会影响销售，对产业发展产生不良影响。目前，主要还是采用化学药剂来防治柑橘溃疡病，根治起来较为困难。因此，选育抗病品种便成为解决这一问题的最有效途径。由于对柑橘溃疡病的抗性机理还不清晰，抗病品种的选育进展缓慢，目前还未育成有经济价值的抗病品种。

柠檬是重要的高酸类柑橘栽培种，其主要品种有尤力克、里斯本、费米耐劳、菲诺等，均是柑橘溃疡病的高感品种[5]。分子标记研究结果表明，柠檬 [Citrus limon（L.）Burm. f.]是枸橼和酸橙类的杂交种[6-7]；由于其亲本之一的枸橼已被鉴定为是柑橘溃疡病的抗病种类[8]，含有对溃疡病的抗性基因 ；所以柠檬对溃疡病的感病性状应该来自于酸橙。由此推测，柠檬中控制柑橘溃疡病抗性的基因应该为杂合状态，其自交后代有可能出现抗性分离。因此，研究拟利用感溃疡病柠檬品种尤力克为材料，构建自交群体，对其后代进行溃疡病的离体抗性鉴定，以期筛选出抗溃疡病的柠檬植株，并初步分析其抗病性状的遗传特征，为抗溃疡病柑橘的选育打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为感溃疡病柠檬品种尤力克。在尤力克成年树开花前用防虫网单株隔离，促使自花授粉，待果实成熟后，取出柠檬种子。在温室播种获得实生苗。研究鉴定的 114 株柠檬自交后代实生苗均保存在湖南农业大学国家柑橘改良中心长沙分中心的温室内。

1.2 试验方法

1.2.1 溃疡病菌准备 取保存于 -80℃的溃疡病菌液按“Z”字型划线到 LB固体培养基，28℃活化培养 3 d。挑取单菌落于 20 mL LB 液体培养基中，在 28℃、200 r/min 的 摇 床 上 培 养 18 h。 取 活 化 菌 液 5 mL，7 500 r/min 离心 5 min，弃上清液，加入无菌水，重复此操作一次。在紫外分光光度计下用无菌水调节后测得 OD600为 0.6，再用无菌自来水重悬菌液浓度至108CFU/mL，并依次稀释到 107、106、105、104、103、102和 10 CFU/mL 备用。

1.2.2 接种浓度的筛选 用最感病的冰糖橙和抗病的枸橼 C-05 刚达到最大叶面积、未革质化的黄绿色健康新叶进行所有溃疡病菌浓度的离体注射接种，以注射清水为对照，观察冰糖橙和枸橼 C-05 接种不同浓度菌液后的症状，最终选择4个适宜浓度的溃疡病菌液用于柠檬自交后代的抗性鉴定。

1.2.3 注射接种 选取刚达到最大叶面积、未革质化的黄绿色健康新叶进行离体注射接种，在同一叶片上分别接种不同浓度的溃疡病菌液，以清水为对照。接种后的叶片置于干净培养盒的湿润滤纸上，封上保鲜膜，在 28℃恒温光照条件下保湿培养，观察叶片症状。每个处理重复3次，分别记录每个浓度条件下，柠檬自交后代对溃疡病的表现症状，出现明显病斑（水渍状、黄色晕圈、愈伤状突起、病菌扩张）则为感病，出现坏死斑点（褐色坏死、病菌不扩张）则为抗病。以最为感病的冰糖橙和抗病的枸橼 C-05 植株相同发育阶段的叶片为对照。

1.2.4 针刺接种 从 70 株柠檬自交后代中选取刚达到最大叶面积、未革质化的黄绿色健康新叶进行离体针刺接种，用注射器针尖在叶面轻轻扎两组小孔，每组 4 个，用被 108CFU/mL 溃疡病菌菌液充分浸泡的带菌小滤纸片覆盖在针刺孔上，放置于干净培养盒的湿润滤纸上，封上保鲜膜，在 28℃恒温光照条件下进行保湿培养，观察叶片症状。以最感病的冰糖橙和抗病的枸橼 C-05 为对照。每个处理重复 3 次试验，分别记录每组中明显病斑数（愈伤状突起）。发病率＝病斑数/总的针刺点数。

2 结果与分析

2.1 接种浓度的筛选

从图1 中可以看出，冰糖橙注射 103CFU/mL 溃疡病菌菌液后，出现零散愈伤状突起症状 ；注射 104CFU/mL 菌液后，愈伤状突起增加 ；注射 105CFU/mL菌液后，愈伤状突起变为海绵状，叶片开始溃败；注射 106CFU/mL 菌液后，叶片溃败，病斑扩张 ；注射更高的浓度的溃疡病菌菌液后，叶片短时间内溃烂，无法进行观察 ；注射清水后不发病。枸橼 C-05 注射103CFU/mL 溃疡病菌菌液后，出现坏死斑点 ；注射104CFU/mL 菌 液后，出现坏死斑块 ；注射 105CFU/ mL 菌液后，坏死斑块不扩张 ；注射 106CFU/mL 菌液后，病斑褐化坏死；注射清水后不发病。这说明选用 103、104、105和 106CFU/mL 的溃疡病菌浓度对柠檬自交后代注射接种能看到从轻微发病到严重发病的症状范围。因此，试验确定如图2所示进行注射接种。

2.2 注射接种鉴定结果

图1 冰糖橙与枸橼 C-05 接种不同浓度溃疡病菌菌液后的症状表现（图中上排为糖橙，下排为枸橼 C-05）

图2 注射接种浓度

试验中发现，各处理叶片离体注射溃疡病菌后，第4天便有部分叶片出现水渍状斑点症状，随后陆续有新病斑出现，且病斑不断扩大 ；接种 7 d 后，不再有新的病斑出现 ；接种 10 d 后，所有叶片的病症不再扩大。因此，选用注射接种 10 d 后叶片的症状表现对各处理植株进行抗病性的最后评价。从表1中可以看出，在离体注射接种的 114 株柠檬自交后代实生苗中，当注 射的菌 液 浓度 为 103CFU/mL 时， 有 55 株出现病症，属于感病植株；有59株没有表现症状，属于抗病单株，占鉴定总数的 51.75% ；当菌液浓度为 104CFU/mL 时，有 24 株没有表现症状，属于抗病单株，占鉴定总数的 21.05% ；当菌液浓度为 105CFU/mL 时，有7株没有表现症状，属于抗病单株，占鉴定总数的6.14% ；当 菌 液 浓 度 为 106CFU/mL 时， 所 有 柠 檬 自交后代实生苗均出现病症。7 株抗 105CFU/mL 溃疡病菌的植株分别为 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39， 可以初步认定这7株柠檬为抗溃疡病单株。部分柠檬自交后代注射溃疡病菌 10 d 后的症状如图3 所示。

表1 114 株柠檬自交后代注射接种鉴定结果

2.3 针刺接种鉴定结果

如图4 所示，冰糖橙在 108CFU/mL 溃疡病菌浓度下，所有针刺口出现愈伤状突起，发病率为 100 %；枸橼 C-05 在 108CFU/mL 溃疡病菌浓度下，针刺口出现坏死状斑点，发病率为0。

由表2可知，鉴定的70株柠檬自交后代实生苗中，在 108CFU/mL 溃疡病菌浓度下，其中有 40 株发病率在 80%～100% 之间，有 16 株发病率在 60%～80%之间，有 3 株发病率在 40%～60% 之间，有 11 株发病率在 0%～40% 之间。由此可知，发病率在 40%～100 %之间的植株对溃疡病表现为感病，植株数量为59株，占 鉴 定 总 数 的 84.28 % ；发 病 率 在 0%～40% 之 间 的植株对溃疡病具有抗病性，植株数量为11株，占鉴定 总数的 15.71 %。这 11 株 抗病植株 分别为 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39 和 NMZJ-191。 其 中，NMZJ-191 针 刺 接 种后的症状如图4所示。

表2 70 株柠檬自交后代针刺涂菌接种鉴定结果

2.4 2 种鉴定结果的比较

图3 部分柠檬自交后代注射接种 10 d 后的症状（121 为感病植株，386 可抗 103CFU/mL 的溃疡病菌菌液，471 和 716 均可抗 104CFU/mL 的溃疡病菌菌液）

图4 针刺接种 108CFU/mL 溃疡病菌后各品种的症状表现（从左至右依次为冰糖橙 BTC、柠檬自交 126 号、柠檬自交 191 号和枸橼 C-05）

对比 2 种鉴定方法，发现注射接种表现为抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株与针刺接种表现为发病率在 0%～40% 之间的植株在抗病性上的差异较小，在田间对溃疡病均表现为抗病。由注射接种法鉴定的 7 株抗 溃疡 病（105CFU/mL） 植株 分别 为 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-202、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39 ；由 针 刺 接 种法 鉴定 的 11 株抗 溃 疡 病 植 株 分 别 为 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-100、NMZJ-144、NMZJ-160、NMZJ-172、NMZJ-222、NMZJ-343、NMZJ-383、NMZJ-39 和 NMZJ-191。 其中，有6株柠檬自交后代在2种鉴定方法中均被认定为抗病株。这表明这6株的抗溃疡病性状比较稳定，分别为 NMZJ-47、NMZJ-80、NMZJ-144、NMZJ-343、NMZJ-383 和 NMZJ-39。

3 小结与讨论

通过大量田间调查和长期的栽培观察发现，不同柑橘品种对柑橘溃疡病的敏感性差异明显[9-10]。在自然条件下，柑橘植株对溃疡病的敏感性程度受到病原菌浓度及致病力、气候条件、植物生长发育阶段和人为因素等的影响。而实验室离体接种鉴定能保证在病原菌浓度单因素变化条件下研究不同柑橘品种对溃疡病的敏感性差异。离体叶接种法病症表现较快，发病率较高，试验过程不受外来因素的影响，操作简单，结果可靠，而且试验后菌源便于销毁，可避免扩散。刘利平[11]通过比较针刺接种的发病症状、发病率、针刺接种 7 d 的病斑大小以及注射接种的病斑数来判断不同柑橘品种对溃疡病的耐抗性关系。该研究是通过对比注射接种和针刺接种2种离体接种方法对柠檬自交后代鉴定结果进行分析，注射接种法中表现为抗 104和 105CFU/mL 病原菌的植株有 24 株，针刺接种法中表现为抗 108CFU/mL 病原菌的植株有 11 株；其中，有6株柠檬自交后代在两种鉴定方法中均被认定为抗病株，这6株的抗病性属于比较稳定的。因此，综合两种鉴定方法，114 株柠檬自交后代对溃疡病表现出不同程度的抗性，共有29株自交后代对溃疡病表现出抗 104CFU/mL 病原菌。

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[11]刘利平 . 柑橘溃疡病菌致病性影响因素的研究 [D]. 长沙 ：湖南农业大学，2013.

（责任编辑：成 平）

Vitro Identification of Lemon Self-crossed Seedlings for the Resistance to Citrus Canker Disease

TAN Li-mei1,2，LIU Hui1，ZHU Zhi-mei1,2，ZHOU Dong1，TANG Tian1，DENG Zi-niu1,2，
（1. Horticulture and Landscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. National Center for Citrus Improvement, Changsha 410128, PRC）

For identifying lemon auto-seedling’s resistance to citrus canker, taking fresh lemon leaves as materials, susceptible Bingtang orange and the resistant citron C-05 as contrast, the resistance of 114 lemon self-crossed-seedlings were identified in vitro leaves, by injecting and needle puncturing different concentration of citrus canker. The results showed that there are differences on the resistance to citrus canker between the individual of lemon selfed progenies, 24 of them are resistant to 104and 105CFU/mL citrus canker by injection and 11 of them are resistant to 108CFU/mL citrus canker by needle puncture. Meanwhile, 6 of them are resistant to citrus canker by two methods. In conclusion, 114 lemon auto-seedlings performed variously faced citrus canker, and 29 of them are resistant to 104CFU/mL citrus canker.

bacterial canker disease; lemon self-crossed-seedlings; vitro inoculation; resistance evaluation

S666.5

A

1006-060X（2017）03-0058-05

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.003.017

2016-12-14

国家级大学生创新创业训练计划项目 [（G）SCX1506]

谭李梅（1993-），女，湖南资兴市人，硕士研究生，研究方向：果树遗传育种与生物技术。

并列第一作者：刘 慧

邓子牛