血清Hcy、Cys C联合尿足细胞检测对2型糖尿病肾病的早期诊断价值

刘倩，王彦，胡三强，杨伏猛

(1连云港市第二人民医院，江苏连云港222006；2连云港市第三人民医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)患者最主要的慢性微血管并发症，是导致终末期肾病的主要原因，因此早期诊断DN显得尤为重要[1]。目前，DN的发病机制尚未完全阐明，其早期的诊断也缺乏统一的指标。研究表明，DN的发生与氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等有一定关联[2]。同型半胱氨酸(Hcy)、胱抑素C(Cys C)与机体氧化应激和炎症反应有关，而足细胞是构成肾小球滤过屏障的主要细胞。因此，本研究旨在检测DN患者血清Hcy、 Cys C和尿足细胞等指标，评估其对DN的早期诊断价值。现报告如下。

anomalies over the western Pacific Ocean warm pool and its possible mechanism

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年3月～2016年3月于连云港市第二人民医院内分泌科就诊的2型糖尿病(T2DM)患者130例，依据1999年WHO的糖尿病诊断和分型标准确诊。其中男64例、女66例，年龄(56.1±7.5)岁；排除原发性肾小球疾病、肾小管间质性疾病、急慢性心血管疾病、尿路感染及近期肾毒性药物使用等。根据DN诊断标准[3]，参照尿白蛋白/尿肌酐比值(UACR)分为3组，即正常白蛋白尿组(NA组，UACR<30 mg/g)42例、 微量白蛋白尿组(MA组，UACR 30～<300 mg/g)45例和大量白蛋白尿组(LA组，UACR≥300 mg/g)43例。同时选取体检中心体检健康者40例作为对照组，其中男19例、女21例，年龄(55.8±6.9)岁。本研究经连云港市第二人民医院伦理学委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 血清Hcy、 Cys C水平检测 采集空腹静脉血5 mL，常温3 000 r/min离心10 min，分离出血清。采用贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测血清Hcy、 Cys C水平，Hcy检测试剂盒购自北京九强公司，Cys C检测试剂盒购自上海蓝怡公司，均按试剂盒说明书操作。

1.3 尿足细胞检测方法[4]留取新鲜晨尿10 mL，离心5 min，弃去上清液，尿沉渣用PBS洗3次；沉渣中加入1 mL PBS重悬并平均分配至2个试管，第1管加入PE标记鼠抗人足盂蛋白(PCX)单克隆荧光抗体(美国R&D公司)50 μL作为试验管，第2管加入PBS 50 μL作为对照管，均在4 ℃孵育45 min；离心5 min，用PBS洗3次；沉渣中加入2 mL PBS重悬，并全部转移至BD绝对计数管；置于振荡器上进行充分混匀后，选择中速上BD FACS Calibur 流式细胞仪(美国BD公司)进行检测。以试验管计数减去对照管计数绝对细胞数。绝对细胞数=(荧光标记细胞计数×已知荧光小球总数×稀释倍数)/(荧光小球计数×样本总体积)。

2.3 血清Hcy、Cys C和尿足细胞对DN的早期诊断价值 将对照组和NA组患者作为研究对象，以肾小球滤过率(GFR)<90 mL/min作为DN诊断切点。运用ROC分析显示，血清Hcy、Cys C水平和尿足细胞数量诊断DN的最佳切点分别为8.75 μmol/L、0.76 mg/L和0.73 个/μL，其对应的曲线下面积分别为0.74、0.79和0.76。三个指标联合诊断DN的最佳切点为81%，曲线下面积为0.92。3个指标诊断敏感性Cys C>足细胞>Hcy，且三者联合检测可以显著提高诊断敏感性(P均<0.05)。见表2。

2.1 各组血清Hcy、Cys C水平及尿足细胞数量比较 NA、MA、LA组血清Hcy、Cys C水平及尿足细胞数量均高于对照组(P均<0.05)；并且，随着DN的进展，血清Hcy、Cys C水平及尿足细胞数量逐渐增加(P均<0.05)。见表1。

2 结果

DN是最常见的DM慢性微血管并发症，其病理特征表现为肾小球硬化，一旦出现临床蛋白尿，肾功能将出现不可逆的损伤，是DM患者致死的主要原因之一[5]。Hcy属于含硫氨基酸，是甲硫氨酸循环的代谢产物，是一类具有微血管损伤作用的氨基酸。其能对血管内皮细胞造成损伤，促进脂蛋白氧化、平滑肌细胞增生和血小板聚集，影响肾血管内皮细胞和肾小球基底膜功能。DM患者体内糖脂代谢异常会导致Hcy生成过多，进而诱导氧自由基生成，导致微血管氧化应激损伤[6,7]。Wang等[8]研究显示，DN患者血清Hcy水平显著高于正常人群，并伴随着疾病的加重而升高，并认为Hcy是一个可用于预测早期DN的独立危险因素。Mao等[6]研究也表明，Hcy能够预测DN的发生和进展。DN患者体内Hcy升高的原因可能包括：①由于肾功能受损，其催化Hcy转变为半胱氨酸和α-丁酮酸的代谢途径减弱，从而表现为肾脏清除Hcy能力不足；②DN患者体内含硫氨基酸的代谢和Hcy再次甲基化能力不足，导致体内Hcy产生过多[9]。本研究发现，伴随DM患者尿蛋白的增加血清Hcy水平不断增高，表明血清Hcy对DN的早期诊断和病情判断具有一定的价值。

使用AMOS进行结构方程建模及分析，以找出船员疲劳与疲劳影响因子之间的联系，船员的负荷矩阵见表5，基本研究方法见图2。

表1 各组血清Hcy、Cys C和尿足细胞检测结果比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与NA组比较，bP<0.05；与MA组比较，cP<0.05。

表2 血清Hcy、Cys C、尿足细胞检测对DN诊断价值(%)

3 讨论

2.2 血清Hcy、Cys C和尿足细胞与UACR的关系 血清Hcy、Cys C水平、尿足细胞数量均与UACR呈正相关(r分别为0.83、0.83、0.84，P均<0.05)。

那些所谓的，不甘心、愤怒、悲伤，在我一天天的阅读时光里消失殆尽。当我合上书本，痊愈之后，我开始了，我最璀璨的生活……□

Cys C是一种由所有有核细胞产生的低分子量蛋白，具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂效应，能够自由通过肾小球滤过并被肾小管上皮细胞所重吸收。其生成速度恒定，不受肾脏因素、炎症、感染、肝脏疾病、饮食等因素影响，是反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，同时可反映肾小球和肾小管损伤[10]。Javanmardi等[11]研究发现，血清Cys C是监测早期DN理想的生物标志物，但不能用于判断疾病治疗后的转归。Jeon等[12]研究显示，血清Cys C水平的升高同时反映肾小球滤过率的下降和UACR的升高，可作为预测DN早期诊断的指标。Jeon等[13]也发现，在DM正常蛋白尿阶段，Cys C水平即出现了升高，因此可作为一个潜力的标志物用于判断肾功能的异常。本研究发现，在DM正常蛋白尿阶段，血清Cys C水平即出现升高，且伴随着尿蛋白的增加而升高。

欧洲法院也指出，虽然通常具有管辖权的法院不得对另一成员法院适用的实体法进行比较分析，但可以对其他成员国适用的取证规则、诉讼语言、判决送达期限等程序性规则进行评估⑤Case C 428/15，27 October 2016，para.57.。

在DN早期阶段，肾脏病理学表现为肾小球基底膜增厚和系膜基质扩张，足细胞参与构成肾小球滤过屏障，对大分子物质渗透性起决定性作用。足细胞表面主要标志蛋白(PCX)是一种携带高负电荷的糖蛋白，作用是防止足突塌陷。如肾小球发生病变，脱落的足细胞可伴随尿液排出，因此可对尿中标记的足细胞进行测定[4]。Dalla等[14]研究显示，当DM患者出现微量白蛋白尿时，肾脏足细胞密度出现减少；当病程进展至大量蛋白尿时，则密度降低更为明显。Tagawa等[15]在DM动物模型中发现，足细胞自噬对于保持溶酶体自稳性发挥重要作用；当足细胞脱落出现功能受损时，尿中可以检测到大量蛋白质。本研究结果显示，在DM正常蛋白尿阶段，已经出现足细胞的脱落；且随着疾病进展，脱落足细胞的数量显著增加。由此可以推测，尿中足细胞测定对DN的早期预测具有一定的临床诊断价值。

通过相关性分析还发现，血清Hcy、Cys C水平和尿足细胞数量与UACR呈正相关。进一步研究还发现，3个指标对于DN早期诊断，其诊断敏感性分别为Cys C>足细胞>Hcy，提示联合检测可以显著提高诊断DN的效能。