1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞凋亡活性的影响及机制探讨

顾杰，张昊，张春江，赵丹，刘刚，杨晓萍

(1石河子大学医学院，新疆石河子832003；2石河子大学医学院第一附属医院)

原发性肾小球疾病是导致终末期肾脏病(ESRD)的主要病因。其中，由弥漫性系膜细胞异常增生及细胞外基质病理性集聚引起的系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)，是我国最常见的原发性肾小球疾病。细胞凋亡是指细胞在一定条件下的程序性死亡，其可有效消除在肾脏增生性疾病修复过程中的过度增殖细胞[1]。因此，在MsPGN的治疗中，一方面通过抑制系膜细胞增殖，另一方面通过促进细胞凋亡，可消除过度增殖的系膜细胞，从而达到治疗的目的。研究表明，1,25(OH)2D3可显著抑制体外培养的肾小球系膜细胞(HMC)增殖，促进其凋亡[2]，但其具体机制尚不明确。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)是细胞凋亡发生发展的重要标志，其中Caspase-3活性是反映细胞凋亡的重要指标。表皮生长因子(EGF)能够促进细胞体外增殖[3]。2015年8月～2016年9月，我们通过EGF诱导HMC建立细胞增殖微环境，观察1,25(OH)2D3对HMC凋亡活性以及Akt、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达的影响，探讨1,25(OH)2D3对HMC的促凋亡作用及其凋亡途径，为MsPGN的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及设备 HMC细胞株由湘雅医学院中心实验室提供，经形态学观察及免疫荧光实验鉴定。低糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclong公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；EGF(美国Peprotech公司)；1,25(OH)2D3(美国Sigma公司)；BCA蛋白定量试剂盒、Caspase-3活性测定试剂盒(上海碧云天公司)；兔抗人Caspase-3、Caspase-9、磷酸化Akt(p-Akt)、Akt单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；兔抗人Caspase-8单克隆抗体(美国Thermo公司)；小鼠抗人β-actin单克隆抗体、免疫荧光山羊抗兔IgG、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗(北京中杉金桥公司)。细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)、激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)、PCR反应扩增仪(美国 ABI公司)、Gel DocTMXR+凝胶成像系统(美国Bio Rad公司)。

1.2 细胞培养 用L-DMEM完全培养基(10% FBS，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)进行HMC细胞株复苏，置于5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合至70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化后继续培养，细胞特性稳定时取第3～7代HMC用于实验。

1.3 细胞分组及干预方法 将对数期的HMC按2×105/mL的密度接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后，继续饥饿培养12～24 h，随机分为空白对照组(N组)、EGF组(E组)、1,25(OH)2D3组(V组)、EGF联合1,25(OH)2D3组(EV组)。N组在5%胎牛血清的DMEM培养基中培养。E组在培养基中加入含10 ng/mL EGF的培养液，V组加入含10-8mol/L 1,25(OH)2D3的培养液，EV组加入含10 ng/mL EGF及10-8mol/L 1,25(OH)2D3的培养液。各组均干预48 h。

1.4 各组Caspase-3酶活性检测 采用Caspase-3酶活性试剂盒，利用Caspase-3水解底物蛋白的特性，通过测定吸光光度值间接检测Caspase-3含量，以反映HMC凋亡活性。各组干预48 h后，按Caspase-3活性测定试剂盒的操作说明进行细胞裂解，通过BCA试剂盒测定所提取蛋白的含量，于96孔平底酶标板中配置等量反应体系，包含检测缓冲液80 μL、Ac-DEVD-pNA 10 μL、待测样品10 μL。每组设置3个复孔，充分混匀后37 ℃避光孵育4 h。待颜色变化明显时，于405 nm处测吸光度值。实验重复3次。

1.5 各组Akt、p-Akt、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达检测 采用Western blot法。将各组细胞裂解后，高速离心25 min后取上清，按BCA试剂盒说明书进行配平，加入合适比例的Loading Buffer后煮沸8 min使蛋白变性。依次经过上样电泳、PVDF转膜、5%奶粉(或胎牛血清)封闭、PVDF膜置于一抗孵育(4 ℃摇床过夜)、TBST洗涤6×5 min、二抗室温孵育2 h、滴加ECL发光试剂、X线片曝光、冲洗和扫描后，采用Gelpro软件比较目的条带相对灰度值，表示蛋白相对表达量。以p-Akt、Akt灰度值比值表示各组Akt相对磷酸化水平。

1.6 各组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表达检测 采用荧光实时定量PCR法。取各组细胞，TRIzol法提取RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。Caspase-3引物上游5′-GAAGCGAATCAATGGACTCTG-3′，下游5′-TTGCTGCATCGACATCTGTAC-3′，引物长度150 bp；Caspase-8引物上游5′-GTGTTTC-ACCTTGTGTGAGC-3′，下游5′-CCAGGGGCTGCTCCTTCTT-3′，引物长度160 bp；Caspase-9引物上游5′-AGATGCCACCCCGTTCC-3′，下游5′-CACTGCTCAAAGATGTCGTCC-3′，引物长度180 bp；β-actin上游5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，引物长度151 bp。PCR反应体系为25 μL，42 ℃ 30 min行反转录，99 ℃ 5 min使反转录酶失活。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45个循环。记录每个目的基因扩增的Ct阈值，以相应的β-actin为内参，采用2-ΔΔct计算mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组Caspase-3活性比较 N组、E组、V组、EV组Caspase-3活性分别为1.000±0.003、0.361±0.006、1.375±0.011、0.889±0.005，E组Caspase-3活性低于N组，V组及EV组Caspase-3活性高于N组，EV组Caspase-3活性高于E组(P均<0.05)。

2.2 各组p-Akt/Akt值比较 N组、E组、V组和EV组p-Akt/Akt值分别为0.241±0.004、0.598±0.027、0.048±0.003、0.440±0.05。E组p-Akt/Akt值高于N组，V组p-Akt/Akt值低于N组，EV组p-Akt/Akt值低于E组(P均<0.05)。见图1。

注：1为N组；2为E组；3为V组；4为EV组。

图1 各组HMC中p-Akt、Akt蛋白表达情况(Western blot法)

2.3 各组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达比较 E组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均低于N组，V组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均高于N组，EV组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均高于E组(P均<0.05)。各组Caspase-8蛋白表达量差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1、图2。

表1 各组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达比较

注：与N组比较，*P<0.05;与E组比较，△P<0.05。

注：1为N组；2为E组；3为V组；4为EV组。

图2 各组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达情况(Western blot法)

2.4 各组 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表达比较 E组Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达均低于N组，V组Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达均高于N组(P均<0.05)，EV组Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达均低于V组(P均<0.05)。各组Caspase-8 mRNA表达量差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组Caspase-3、 Caspase-8、Caspase-9 mRNA表达比较

注：与N组比较，*P<0.05；与V组比较，△P<0.05。

3 讨论

目前，原发性肾小球肾炎是导致我国ESRD的首位原因，而MsPGN又在各种肾小球肾炎中发病率最高。MsPGN是病理表现为弥漫性肾小球系膜细胞增生、伴有不同程度系膜基质增生的疾病，早期病变多表现为系膜细胞数量的异常增多，系膜细胞的数量又受细胞增殖和凋亡的双重影响。系膜细胞的异常增殖对肾小球起损害作用，而系膜细胞的凋亡对肾小球损伤的修复起关键作用。研究发现，在Thy-1肾炎模型中，通过细胞凋亡机制可以使增生的肾小球肾炎自行清除，使肾小球结构恢复正常[4]。由此可见，抑制系膜细胞的增殖、促进其凋亡是控制和治疗MsPGN的重要靶点。因此，寻找能够抑制HMC增生并诱导其凋亡的药物对治疗各种肾小球肾炎疾病意义重大。

细胞凋亡具有复杂的发生机制，主要由表面死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径信号通路所调控，前两者被称为经典的细胞凋亡途径。Akt即蛋白激酶B，是生长因子、细胞因子及其他刺激因子发挥作用的核心下游蛋白，参与多种信号通路的调节，在线粒体介导的内源性凋亡通路中发挥重要作用[5]。Wu等[6]研究发现，在线粒体凋亡通路的前阶段，Akt与热激蛋白(HSP)家族中的HSP27相互作用，介导凋亡的发生。磷酸化的Akt可通过降低凋亡信号调节激酶1的活性，产生抗凋亡结合域，阻止细胞凋亡的原癌基因蛋白质与Akt磷酸化的底物结合，Akt磷酸化后也可阻止Caspase-9的活化，进而抑制细胞凋亡[7]。活化的Caspase-3仅在凋亡的细胞中发现，因此检测Caspase-3的活性变化能发现细胞的早期凋亡，从而反映细胞凋亡活性的变化。本研究发现，E组Caspase-3活性低于N组，p-Akt/Akt比值高于N组，提示E组HMC的凋亡活性明显降低，可能与p-Akt/Akt比值增高有关，Akt磷酸化可能参与了促进HMC增殖、抑制其凋亡的过程。

Caspase为半胱氨酸蛋白酶类，是一种在细胞凋亡中具有重要作用的半胱氨酸蛋白酶，分为起始和效应凋亡蛋白酶。通常情况下，Caspase以无活性的酶原存在，在凋亡刺激因子的作用下，起始蛋白酶被活化为有活性的蛋白水解酶，切割下游的效应凋亡蛋白酶，活化的效应凋亡蛋白酶对维持细胞的结构及活动所必需的蛋白进行裂解，进而发挥细胞凋亡作用，最终引起细胞死亡。通常由起始者(Caspase-8、Caspase-9)、活化执行者(Caspase-3)引发凋亡过程。Caspase-3是Caspase家族的主要成员之一，是一种效应凋亡蛋白酶，是多种组织、多种细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子，是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶，在细胞程序性死亡中起关键作用。黄建萍等[8]研究发现，Caspase-3参与了狼疮肾炎患儿肾组织的细胞凋亡过程。Caspase-8作为死亡受体途径的启动因子，诱导活化后可进一步链式水解其下游的同源酶，如Caspase-7、Caspase-6等，最后激活其效应物Caspase-3发生生物效应。研究发现，Caspase-8尚可促进细胞分化、调节自噬并能促进细胞迁移[9]。Caspase-9在细胞凋亡线粒体途径中起重要作用。凋亡因子刺激线粒体释放细胞色素C,促使线粒体形成复合物-凋亡体，进而促使Caspase-9的激活，随后下游Caspase-3被激活，引起细胞凋亡。在凋亡涉及的三条途径中，Akt处于线粒体介导的凋亡通路的交汇点，可以通过磷酸化或与凋亡相关因子相互作用来调节细胞凋亡。Cardone等[10]研究表明，在人胚肾283T细胞中，Akt可通过阻止Caspase-9的活化进行线粒体凋亡后阶段的调节，从而调节细胞凋亡的进程。本研究发现，E组Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达均低于N组，提示促进HMC增殖后，与凋亡相关的Caspase-3、Caspase-9表达均降低，结合E组p-Akt/Akt值高于N组的结果，考虑HMC增殖后，可能通过磷酸化Akt使Caspase-3、Caspase-9表达降低，从而抑制细胞凋亡过程。

1,25(OH)2D3属于类固醇激素，是活性维生素D3的生物活性形式，其生物学效应广泛，除用于钙、磷调节外，还可调节免疫系统、神经系统、肾素血管紧张素及胰岛素分泌。近年研究发现，1,25(OH)2D3可通过抑制细胞增生、促进细胞凋亡，从而减少慢性疾病如糖尿病、系统性硬化等的发生。本课题组前期研究证实，1,25(OH)2D3可抑制体外培养的大鼠系膜细胞增殖并诱导其凋亡，同时还可以促进体外培养的肾小球系膜细胞凋亡[11,12]。本研究发现，V组及EV组Caspase-3活性高于N组，EV组Caspase-3活性高于E组，提示1,25(OH)2D3干预后可使正常HMC的凋亡活性增强，并可使增殖后的HMC凋亡活性增强，表明1,25(OH)2D3可促进HMC的凋亡。

研究发现，1,25(OH)2D3可通过抑制抗凋亡和细胞凋亡抑制因子蛋白表达，促进Caspase-3、Caspase-9表达而促进前列腺癌细胞的凋亡[13]。Yip等[14]研究证实，活性维生素D3可以通过EGFR/PI3K/Akt通路促进鼻咽癌细胞凋亡，其促凋亡作用通过Akt磷酸化Bcl-2家族中的促凋亡因子(Bad、Bax)实现。Ma等[15]研究表明，1,25(OH)2D3可通过PI3K/Akt通路介导的非基因组机制促进腺癌组织中的细胞凋亡。本研究发现，V组Caspase-3活性高于N组，p-Akt/Akt值低于N组，Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达高于N组，提示1,25(OH)2D3可能通过抑制Akt的磷酸化，上调Caspase-3、Caspase-9表达，从而使HMC的凋亡活性增加，促进HMC的凋亡；EV组Caspase-3活性高于E组，p-Akt/Akt值低于E组，Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达高于E组，提示1,25(OH)2D3可使发生增殖后的HMC凋亡活性增强，可能与其抑制Akt磷酸化，进而上调Caspase-3、Caspase-9表达有关。

综上所述，1,25(OH)2D3可增强增殖HMC的凋亡活性，从而发挥促HMC凋亡的作用，其机制可能为通过抑制Akt磷酸化，上调Caspase-3、Caspase-9的表达增强HMC的凋亡活性。