银杏内酯B对大鼠胚胎中脑神经细胞损伤的影响

郭淼，张晓莺，李燕云

(新疆生产建设兵团医院，乌鲁木齐830002)

中脑神经损伤可引起滑车神经以及动眼神经等方面的疾患。一定数量神经细胞的存活是受损中脑神经细胞修复的基础。神经再生是神经发育过程的再现，因此对神经细胞生长发育过程的研究有助于探讨损伤修复的机制，从而为神经损伤的治疗提供依据。银杏内酯B(GB)是银杏叶提取物中的重要成分，目前已用于脑缺血、老年痴呆症、心血管疾病及哮喘等疾病的治疗[4]。海人藻酸(KA)是类似于谷氨酸的一种兴奋性神经毒素，在体内外实验中常被作为引起细胞死亡的经典细胞损伤模型药物。目前，对GB治疗中脑神经损伤的作用尚不明确。 2015年3月～2016年1月，我们应用KA制备大鼠胚胎中脑神经细胞损伤模型，观察GB对细胞存活以及生长的影响，探讨GB对大鼠中脑神经细胞损伤的保护作用及其机制，为GB在神经损伤修复治疗中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器 健康成年雌雄Wistar大鼠各30只，体质量250 g左右，63～70日龄，由中山大学动物实验中心提供。GB、KA、MTT(美国Sigma公司)；胰蛋白酶(1∶250)、HEPES及高糖DMEM干粉培养基(美国Gibco公司)；CO2培养箱(德国Heraeus公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；微量加样器(法国Gilson公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；台式低速离心机TDL-5C(上海菲恰尔分析仪器有限公司)。

1.2 大鼠胚胎中脑神经细胞培养及鉴定 大鼠雌、雄鼠合笼受孕，取30只受孕15 d的孕鼠，脱颈处死后，放入盛有75%乙醇容器内，消毒5 min，于无菌条件下取出胚胎放置于培养基中，取出胚胎中脑组织，用PBS溶液将血污清洗干净，剪碎脑组织，置于37 ℃、浓度为0.25%的Trypsin溶液中浸泡5 min进行消化，之后将消化液吸除，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，将沉淀吹打后制作为单神经细胞悬液[6]。使用台盼蓝进行细胞计数，调整细胞密度为4×108/mL的细胞悬液，接种在涂有10 mg/L的Poly-L-Lysine培养板上，在温度37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。24 h后待细胞贴壁后，全量换液1次。以后每2～3天半量换液。采用神经元特异性免疫组化染色(NSE)鉴定原代培养的神经细胞[8]，经鉴定神经细胞的细胞质呈棕黄色颗粒，即为NSE阳性，中脑神经细胞培养成功。

1.3 细胞分组及干预方法 中脑神经细胞密度调整为4×106/mL，接种于96孔培养板，每孔加50 μL细胞悬液。24 h后，待细胞贴壁，分为对照组、神经生长因子(NGF)组(NGF组)、GB组、KA组、NGF+KA组、GB+KA组。对照组仅在培养基中培养；NGF组在培养基中加入50 mg/L NGF；GB组在培养基中加入50 mg/L GB；KA组在培养基中加入100 μmol/L KA；NGF+KA组在培养基中加入50 mg/L NGF及100 μmol/L KA；GB+KA组在培养基中加入50 mg/L GB及100 μmol/L KA。每组分为6个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养24、48、72、96 h。

1.4 细胞存活率测定 采用MTT法。对各组细胞培养后每隔4 h对每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h。用移液器移除上清液。每孔加入DMSO 150 μL，置于振荡器振荡15 min后，用酶标仪(490 nm波长)在各孔测得A值，即为细胞存活率。

1.5 集落分化率测定 采用Giemsa染色法。各组分为10孔，培养10 d后，对中脑神经细胞集落进行计数。以胞体饱满呈圆形或椭圆形，光晕明显，突起均匀光滑的细胞认为是活细胞；以胞体肿胀或皱缩，形态不规则，空泡化，突起断裂呈串珠样甚至消失认为是细胞受损或死亡。细胞用4%甲醛固定，再放入37 ℃培养箱内孵育过夜，次晨冲洗2次，Giemsa染色，经Leica采集图像观察染成蓝色的胚胎中脑神经细胞集落，计数集落数，以对照组集落数为100%，计算中脑神经细胞集落分化率。

2 结果

2.1 各组细胞存活率比较 对照组在24、48、72、96 h时细胞存活率无明显变化。KA组在48、72、96 h时细胞存活率均低于对照组(P均<0.05)；NGF+KA组、GB+KA组在48、72、96 h时，细胞存活率均高于KA组(P均<0.05)；NGF组、GB组在72、96 h时，细胞存活率均高于对照组(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组中脑神经细胞集落分化率比较 对照组、NGF组、GB组、KA组、NGF+KA组、GB+KA组集落分化率分别为100%、131%、134%、29.5%、29.5%、86.1%、82.1%，NGF组、GB组集落分化率均高于对照组(P均<0.05)，KA组、NGF+KA组、GB+KA组集落分化率均低于对照组(P均<0.05)，NGF+KA组、GB+KA组集落分化率均高于KA组(P均<0.05)。

表1 各组细胞存活率比较

注：与同时点对照组比较，*P<0.05；与同时点KA组比较，△P<0.05；与同组24 h时比较，#P<0.05。

3 讨论

神经再生是神经发育过程的重演，受多种机制所调控[9～11]。对神经细胞生长发育过程的研究有助于探讨损伤修复的机制，从而为神经损伤的治疗提供依据。神经营养因子如NGF、脑源性神经营养因子(BDNF)可以促进损伤大鼠中脑神经细胞突起的生长，有助于中脑神经细胞的功能恢复。但是，这些神经营养因子通过血脑屏障的能力较弱，不良反应较多[1～3]。因此，寻找可以透过血脑屏障同时有神经保护作用的小分子物质，是目前防治中脑损伤研究的一个新思路。

银杏叶提取物的活性成分主要是黄酮、内酯，目前已分离出银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯等五种内酯[15]。其中，GB是银杏叶提取物中的重要成分，也是血小板活化因子受体的天然拮抗剂，其特异性抗血小板活化因子的作用最强。据报道，GB可保护细胞膜的稳定性，显著降低大脑皮层细胞乳酸脱氢酶释放；减少亚硝酸根离子形成的毒性，降低丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，导致NO的毒性减弱，对自由基对细胞膜和线粒体损伤引起的神经细胞损伤具有拮抗作用；改善新陈代谢；提高细胞膜通透性；使细胞内环境得以良性循环。与此同时，GB能减轻KA诱导的神经细胞内钙离子的超载，进而对神经细胞起保护作用[16,17]。目前，GB制剂主要用于心血管疾病、脑缺血、脑老化、老年痴呆症及哮喘病的治疗。但GB对脑细胞的影响作用尚不明确。本研究发现，NGF+KA组、GB+KA组细胞存活率均高于对照组，表明GB和NGF均能改善由KA诱导的胚胎中脑神经元损伤。本研究结果显示，NGF组、GB组在72、96 h时细胞存活率均高于对照组，提示GB在72 h后能够明显促进大鼠胚胎中脑神经细胞的生长，并且对大鼠胚胎中脑神经细胞的生长起保护作用，具有与NGF相同的功能。

细胞集落表示细胞独立生存能力，细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力时，细胞集落率高。本研究发现， NGF+KA组、GB+KA组集落分化率高于KA组，提示GB能促进胚胎大鼠中脑神经细胞的生长与分化， 其保护中脑神经细胞的作用与NGF相似。

综上所述，GB能有效对抗KA对大鼠中脑神经细胞的毒性作用，其作用机制可能与GB促进中脑神经细胞的生长与分化有关。