氯沙坦对动脉粥样硬化兔主动脉内皮细胞凋亡的影响及机制探讨

黄文，谈红，王潞，晋群

(1武警山东省总队医院，济南250014；2济南军区总医院)

内皮功能损伤在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起到重要作用。引起内皮功能损伤的因素众多，其中内皮细胞凋亡是重要因素之一。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)抑制剂广泛应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病(以下简称冠心病)的治疗，可改善患者的长期预后。近年研究发现，血管紧张素Ⅱ1型受体阻断剂(ARB)氯沙坦具有保护血管内皮细胞功能的作用，但其作用机制尚不完全明确。2016年3～7月，我们观察了氯沙坦对兔动脉粥样硬化模型粥样斑块内皮细胞凋亡的影响，探讨氯沙坦对粥样斑块内皮细胞的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及干预方法 14周龄雄性清洁级新西兰大白兔25只，体质量(2.2±0.2)kg，购自济南西岭角养殖繁育中心。将25只兔随机分为正常对照组5例、高胆固醇组10例、氯沙坦组10例。高胆固醇组、氯沙坦组均以高脂饲料(含1%胆固醇和0.5%猪板油)喂养，正常对照组以普通饲料喂养。氯沙坦组同时给予氯沙坦25 mg/(kg·d)灌胃，正常对照组和高胆固醇组给予同等剂量的生理盐水灌胃。共干预16周。

1.2 主动脉内皮细胞形态观察 干预结束后处死各组兔，取主动脉弓处1 mm3左右动脉组织，2.5%戊二醛固定，制成超薄组织切片，采用JEM-1200EX透射电镜观察选取组织的超微结构。

1.3 内皮细胞增殖周期及凋亡检测 于髂总动脉分叉以上取2 cm主动脉，仔细分离内膜层，70%乙醇固定，充分研磨，过滤后1 500 r/min离心5 min，加入PI工作液0.5 mL，避光30 min。调整流式细胞仪，变异系数稳定在2%以内，收集2×104个细胞，检测完成后根据流式细胞图分析细胞周期和凋亡率，以G0、G1期为细胞静止期，S、(G2+M)期分别为细胞分裂前期和分裂期，以ModiFit软件进行数据分析，计算细胞凋亡率。

1.4 动脉壁内c-myc蛋白表达检测 采用免疫组化法。取主动脉组织，以c-myc鼠单克隆抗体进行免疫组化染色，c-myc阳性颗粒呈棕黄色，在细胞核和核浆中均有表达。在400倍光学显微镜下观察10个视野，计数阳性细胞所占细胞总数的百分比，取其平均值。采取半定量记分，表达阴性为0分，阳性细胞数<25%为1分，阳性细胞数25%～50%为2分，阳性细胞数51%～75%为3分，阳性细胞数>75%为4分。

1.5 动脉壁内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspases-3) mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取-80 ℃保存的动脉壁组织，TRIzol法提取总RNA。引物序列：5′-TTTGTTTGTGTGCTTCTTCTGAGGCC-3′，5′-ATTCTGTTGCCACCTTTCGG-3′。扩增条件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环。以GAPDH做为内参照，Caspases-3与GAPDH扩增条带的光密度比值作为Caspases-3相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料比较采用完全随机设计的t检验；以Ridit检验计算半定量资料平均Ridit值(Ri)和95%可信区间(95%CI)，组间Ri比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组主动脉内皮细胞形态变化 正常对照组主动脉内皮细胞呈扁平梭形，核较小，核周的胞质较丰富，含有高尔基复合体、中心体、多胞体和溶酶体等。高胆固醇组内皮细胞通透性增高，细胞间连接结构破坏、断裂甚至发生变性和脱落，核浓缩，染色质浓缩，胞核体积缩小，可见凋亡小体。氯沙坦组内皮细胞损伤明显改善，未见凋亡小体形成。

2.2 各组内皮细胞增殖周期比例及细胞凋亡率比较 正常对照组、氯沙坦组细胞均以静止期为主，而高胆固醇组细胞以分裂前期及分裂期为主。由于细胞增殖周期各组标准差较大，各组比较差异无统计学意义。正常对照组及氯沙坦组细胞凋亡率均低于高胆固醇组(P均<0.01)。见表1。

表1 各组血管内皮细胞增殖周期比例及细胞凋亡率比较

注：与高胆固醇组比较，*P<0.05。

2.3 各组动脉壁内c-myc蛋白表达比较 正常对照组、高胆固醇组、氯沙坦组c-myc阳性表达半定量评分分别为1.000、3.143、1.500，Ri分别为0.19、0.73、0.39，95%CI分别为-0.11～0.49、0.52～0.94、0.15～0.63，高胆固醇组c-myc表达高于正常对照组，氯沙坦组c-myc表达低于高胆固醇组(P均<0.05)。

2.4 各组动脉组织Caspeses-3 mRNA表达比较 正常对照组、高胆固醇组、氯沙坦组高胆固醇组动脉组织Caspeses-3 mRNA相对表达量分别为0.51±0.14、2.44±1.13、1.48±0.52，高胆固醇组动脉组织Caspeses-3 mRNA表达高于正常对照组(P<0.01)，氯沙坦组动脉组织Caspeses-3 mRNA表达低于高胆固醇组(P<0.01)。

3 讨论

内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期阶段，也是动脉粥样硬化的始动因素，同时也是发生动脉粥样硬化的必备条件。近年来，动脉粥样硬化斑块中细胞凋亡的作用引起关注。粥样斑块的消退与细胞凋亡密切相关[1]。Gonzalez等[2]研究发现，巨噬细胞凋亡在粥样斑块发展、斑块内坏死核心产生和易损斑块形成中起到重要作用。内皮细胞凋亡可通过影响内皮损伤修复功能、导致血管舒缩功能障碍[3]、增加斑块不稳定性、促进血栓形成和急性冠脉事件的发生[4]，从而参与动脉粥样硬化的发生发展。近年研究表明，RAAS可通过一系列作用机制，与动脉粥样硬化的发生、发展，如促进血管内皮细胞增殖、抑制其凋亡、引起内皮功能失调、诱导癌基因表达、抑制纤溶、与激肽系统相互作用等。因此，RAAS与动脉粥样硬化的关系已成为新的研究热点[5]。

氯沙坦作为血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂，早先作为抗高血压类药物广泛应用于临床，近年研究发现，除降压作用以外，氯沙坦还可以改善心室重构、改善内皮功能，进而改善冠心病患者的长期预后，但其作用机制有待进一步研究[6]。Derosa等[7]研究发现，氯沙坦联合应用钙离子拮抗剂可显著改善糖尿病和高血压患者的内皮损伤和氧化应激。Zhu等[8]研究发现，自发性高血压大鼠给予氯沙坦治疗后，内皮细胞结构更加平滑完整，内皮损伤得到改善。本研究发现，与高胆固醇组比较，氯沙坦组的内皮细胞损伤明显改善，未见凋亡小体形成，静止期细胞比例增加、分裂前期及分裂期细胞比例减少，细胞凋亡率降低，提示氯沙坦可抑制动脉粥样硬化兔的主动脉粥样斑块凋亡，表明氯沙坦可能通过抑制内皮细胞凋亡而延缓动脉粥样硬化进程。

Caspases蛋白酶是一组半胱氨酸蛋白酶家族，具有蛋白酶的生物学特性。人类Caspases基因有12种，多数与凋亡有关[9]，其中Caspases-3参与凋亡过程的终末期，在凋亡病理过程中起到重要作用。Hachani等[10]以高胆固醇饮食诱发去交感神经大鼠动脉壁内细胞的凋亡，检测到Caspases基因的表达显著增加。Lloyd给予人冠状动脉内皮细胞以氧化应激刺激，发现内皮细胞的凋亡呈现Caspases依赖性，包括Caspases-3、7，说明Caspases途径在凋亡发生机制中的重要调节作用[11]。也有研究发现缺氧导致的成人心肌细胞凋亡有Caspases基因的参与[12]，应用Caspases 抑制剂可减少缺血及再灌注损伤[13]，同时Caspases-3还可以调控心肌病心衰患者的心肌细胞凋亡[14]。总之，Caspases 与心血管疾病相关的细胞凋亡密切相关。本研究发现，氯沙坦组动脉组织Caspeses-3 mRNA表达低于高胆固醇组，提示氯沙坦可显著抑制动脉粥样斑块内Caspeses-3 mRNA的表达，可能参与抑制内皮细胞凋亡的过程，从而延缓动脉粥硬化的发生发展。

c-myc蛋白为核内结合蛋白，具有细胞转化的能力，在调节细胞生长、分化及恶性转化中起重要作用。c-myc蛋白被激活时，可结合到基因组中特定的调控序列，进一步激活与细胞增殖和分化有关的基因，促进细胞增殖，抑制凋亡。在球囊损伤引起的大鼠平滑肌细胞增殖和内膜增生中存在c-myc表达的增加[15]，虎杖苷通过激活eNOS/SIRT1途径，抑制c-myc表达，抑制氧化应激诱导的血管平滑肌细胞增殖[16]。Inafuku等[17]研究了日本鹌鹑主动脉粥样硬化斑块中细胞周期调节基因和蛋白，发现c-myc mRNA的表达显著增加。因此，c-myc是细胞增殖调节的重要蛋白之一。本研究发现，氯沙坦组动脉组织c-myc蛋白表达低于高胆固醇组，提示氯沙坦可显著抑制动脉粥样斑块内c-myc蛋白的表达，可能参与抑制内皮细胞凋亡的过程，从而延缓动脉粥硬化的发生发展。

综上所述，氯沙坦可显著抑制动脉粥样斑块形成，其作用机制可能与下调c-myc、Caspases-3表达，进而抑制内皮细胞凋亡密切有关。