放射性脑损伤对小鼠情绪的影响及机制探讨

李涛，张慎贵，赵文博，宋岩，王新立，于永慧，孙晋浩，王洪杰

(1济南市第四人民医院，济南250031；2山东大学基础医学院；3山东大学齐鲁医院；4山东省立医院)

放射性脑损伤是指对脑部或脑邻近部位实施放射治疗后引起的脑组织损伤。研究发现，放疗患者经常会出现进行性认知功能障碍[1]和情绪异常，如焦虑、抑郁等，严重影响患者的生存质量[2]。目前，对放射性脑损伤导致情绪变化的原因尚不明确。2016年1～6月，我们采用8 Gy照射剂量建立放射性脑损伤小鼠模型，采用开场实验和悬尾实验评价小鼠的情绪变化，并观察小鼠海马神经元形态变化，探讨放射性脑损伤对情绪的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 4～6周龄C57BL/6J雄性小鼠24只，购于山东大学基础医学院动物室。将小鼠随机分成对照组、照射组各12只。动物实验程序通过了山东大学动物保护和使用委员会批准，遵守照顾和维护实验动物的法律授权和国家的指导方针。

1.2 照射方法 照射组进行头部电子线照射建立放射性脑损伤模型。使用Elekta Precise直线加速器，20 cm×20 cm电子线限光筒，制作1 cm厚度铅模，照射野大小2.0 cm×1.5 cm，使照射野上界位于小鼠双眼后眦连线，下界位于双耳后连线，以保护双眼、鼻腔及口腔。照射前使用4%水合氯醛腹腔注射后，俯卧位固定于自制圆形木板上，使小鼠脑部与限光筒铅模射野一致。给予6 MeV电子线、400 mu/min剂量率、源皮距100 cm、8 Gy的组织吸收剂量行一次性照射，建立放射性脑损伤模型。对照组麻醉后放在相似的环境中，但不进行照射。

1.3 焦虑反应评价 采用开场实验评价动物焦虑反应。所有小鼠于照射后第7天行开场实验检测。使用活动观察箱大小为40 cm×40 cm×40 cm，底面等分为25个格子，依次将每只小鼠轻放于箱中，使用自发活动分析软件分析10 min内小鼠的自发活动情况。将中央3/5的区域定义为中央区域，记录小鼠中央区域的活动路程及活动总路程、中央区活动时间、活动次数、10 min内粪便数量。

1.4 抑郁反应评价 开场试验后，小鼠休息2 h，行悬尾试验。在悬尾实验操作箱顶部中心绳连有一个小书夹，夹住裹有小鼠尾尖(尾巴末端0.5～1 cm)的胶布并使之倒悬，小鼠头部距离底部4～5 cm。总时间为6 min，记录后4 min内小鼠的悬尾不动时间。悬尾不动判断标准：小鼠四肢完全不动或仅有足部轻度挣扎动作。

1.5 海马组织病理观察 照射后第7天行开场实验及悬尾实验检测后，将小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸，经左心室插管至升主动脉，先用生理盐水 100 mL 快速冲洗，随后用PBS液200 mL先快后慢进行灌注，灌注后30 min取脑，放入10%甲醛溶液中固定，12 h后取材、脱水、包埋、切片、烤片、染色、封片。显微镜下观察海马神经元细胞形态。

2 结果

2.1 两组焦虑反应指标比较 与对照组比较，照射组中央区活动时间增加，活动次数、10 min内粪便数量均减少(P<0.05或0.01)。两组活动总路程、中央区活动路程差异无统计学意义。见表1。

表1 两组焦虑反应指标比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

2.2 两组抑郁反应指标比较 对照组、照射组悬尾不动时间分别为(52.00±7.61)、(74.16±13.35)s，照射组悬尾不动时间长于对照组(P<0.01)。

2.3 两组海马组织病理表现 对照组海马各部位结构及层次清楚，细胞形态完整，结构清晰，染色均匀。照射组海马神经元变性坏死，细胞体积变大，细胞质内空泡变性、核固缩，染色不均匀。见图1。

3 讨论

放射治疗是治疗鼻咽癌、脑胶质细胞瘤、转移瘤等头颈部肿瘤的主要方法之一，随着立体定向放疗、三维适形调强放疗等放疗技术的不断发展，肿瘤患者的生存时间不断延长，但放疗所导致的放射性脑损伤越来越受到广泛的关注。急性放射性脑损伤多数发生在照射后很短时间内，一般为1～7 d，主要由放射线对脑组织的直接损伤作用、血脑屏障受损、通透性增加等所致的脑水肿导致[3,4]。研究表明，单次照射剂量>3 Gy及照射野体积过大均可以导致急性放射性脑损伤的发生[5]。放射性脑损伤患者的常见临床症状包括头痛、肢体活动障碍、认知功能障碍和情绪改变等。情绪改变是放射性脑损伤后常出现的症状之一。范兴文等[6]研究发现，脑部照射1个月后可导致大鼠活动度降低、焦虑水平增加。但目前，对于急性放射性脑损伤后的情绪障碍尚待深入研究。

注：A为对照组；B为照射组。

图1 两组小鼠海马组织病理表现(HE染色，×100)

开场实验是评价焦虑行为的常用方法之一[7]。因动物在敞箱中会对新鲜环境产生恐惧，主要在敞箱内的周边部活动，中央区域对其来说具有潜在的威胁，故而在中央区活动较少，从而可以反映其焦虑水平变化。开场试验中动物排便数量通常作为一个测量动物焦虑行为的指标。本研究结果显示，与对照组比较，照射组中央区活动时间、活动次数、10 min内粪便数量均减少，表明小鼠在放射性脑损伤后急性期焦虑水平升高。小鼠悬尾试验是最常用的监测动物抑郁行为的实验，以一定时间内小鼠的悬尾不动时间来反映其绝望情绪。本研究发现，与对照组相比，照射组小鼠的悬尾不动时间明显延长，表明放射性脑损伤急性期小鼠抑郁水平明显升高。

海马在学习记忆和情绪调节中都起重要作用。研究发现，海马对射线具有高度敏感性，射线照射后，海马神经元数量明显减少、突触密度明显降低，并呈现放射剂量依赖性，这种变化可以持续至少1个月[8]。研究证明，颅内照射海马齿状回区神经干细胞后可导致一些神经心理缺陷，其原因可能与照射后海马神经减少、血脑屏障破坏、突触密度降低、脱髓鞘等有关[9～11]。射线照射后损伤加重的机制可能与神经兴奋性毒性、炎性反应、应激反应、血管内皮老化等有关[12～14]。本课题组前期研究发现，X线照射能抑制海马神经干细胞增殖，并通过激活胱天蛋白酶-1诱导神经干细胞凋亡，使用胱天蛋白酶-1抑制剂阻断体内和体外胱天蛋白酶-1激活后，神经干细胞凋亡减少[15]。本研究发现，照射组海马神经元变性坏死，细胞体积变大，细胞质内空泡变性、细胞核固缩，提示照射后可使小鼠海马组织变性坏死，放射性脑损伤急性期出现的焦虑抑郁水平升高可能与海马神经元损伤有关。

综上所述，放射性脑损伤可导致小鼠焦虑及抑郁水平升高、活动度减低，其原因可能与海马神经元受损有关。