慢性氟中毒大鼠肾组织Beclin1、LC3、p62、Bcl-2表达变化及意义

陈荣，于燕妮，徐淋，邓超男

(贵州医科大学，贵阳550004)

氟是一种化学性质极为活泼的卤族元素，也是机体内所必需的微量元素之一。适量的氟对细胞代谢有着重要作用，但过量的氟则导致机体损伤。慢性氟中毒分为骨相和非骨相损伤，骨相损伤主要累及骨、软骨及牙齿[1]，非骨相损伤主要累及肝、肾、神经、内分泌、生殖系统等，而肾是非骨系受损最严重的器官之一。由于肾脏组织中肾小管主要功能为重吸收，机体内绝大多数物质在此重吸收。因此，长期过量的氟摄入机体可使肾小管负荷过重，导致肾脏损伤。氟中毒致肾脏损伤的病理机制十分复杂，研究发现，凋亡是参与慢性氟中毒肾损伤的机制之一[2]。凋亡、自噬都属于细胞程序性死亡，其中凋亡是机体细胞程序性死亡Ⅰ，自噬是机体细胞程序性死亡Ⅱ。在饥饿、氧化等应激状态下，机体可通过自噬功能清除受损细胞和代谢废物，参与细胞增殖、生长、凋亡、维持细胞内环境稳态和细胞正常的生理功能[3]。但凋亡与自噬是否共同参与慢性氟中毒肾损伤的机制尚不明确。2015年3月～2016年8月，我们检测了慢性氟中毒大鼠肾组织中自噬相关因子微管相关蛋白1(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62及抗凋亡因子B细胞淋巴瘤基因/白血病基因-2(Bcl-2)的表达变化，探讨自噬与凋亡在慢性氟中毒肾损伤中的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 4～5周龄SD大鼠36只，由贵州医科大学动物中心提供。兔抗鼠多克隆抗体Beclin1、Bcl-2、p62(美国Abcam公司)；兔抗鼠多克隆抗体LC3(美国Cell Signaling公司)；PV-6001兔二步法免疫组化试剂盒、过氧化氢(H2O2)、苏木素、柠檬酸盐(北京中山金桥生物技术有限公司)；二氨基联苯胺(DAB)、磷酸盐缓冲液(北京中山金桥生物技术有限公司)；NaF分析纯(天津市致远化学试剂有限公司)；RT-PCR试剂盒(美国Thermo公司)；总RNA提取试剂TRIzol(美国Invitrogen公司)。

1.2 分组及模型制备 采取随机数字法将36只大鼠随机分为对照组、低氟组、高氟组，每组各12只(雌雄各半)。对照组饮用含氟化钠低于1 mg/L自来水，低、高氟组饮用含氟化钠分别为5、50 mg/L的自来水。干预6个月后，收集24 h尿液测尿氟，股动脉放血处死，取股骨测骨氟。以低氟组及高氟组大鼠出现氟斑牙，尿氟、骨氟明显增高，肌酐、尿素氮明显增高，证实氟中毒引起肾损害，表明氟中毒肾损害大鼠造模成功。

1.3 各组肾组织病理观察 造模后股动脉放血处死大鼠，取一侧肾脏于4%甲醛中固定、脱水，常规石蜡包埋，切片3 μm做HE染色，光镜下观察肾组织的病理形态学改变。

1.4 各组肾组织Beclin1、LC3、p62及Bcl-2蛋白表达检测 采用免疫组织化学SP两步法。取肾组织石蜡切片，脱蜡至水，高压修复5 min，3%H2O237 ℃孵育10 min，山羊血清封闭20 min，分别滴加1∶200的Beclin1、LC3、Bcl-2一抗，1∶100的p62一抗；4 ℃过夜。次日复温0.5 h，加二抗孵育20 min，DAB显色，流水终止反应；苏木素复染、脱水、透明、封片。用PBS代替一抗其他条件相同作为对照。用BIOMIAS-2001分析软件进行图像分析。

1.5 各组肾组织Beclin1、LC3、p62、Bcl-2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取肾组织放于-80 ℃冰箱，于研钵中加入液氮研磨，加入TRIzol试剂，提取肾组织RNA，以β-actin作内参。Beclin1上游引物5′-AGTGGCGGCTCCTATTC-3′，下游引物5′-GGACACCCAAGCAAGAC-3′；LC3上游引物5′-TTCGCCGACCGCTGTAA-3′，下游引物5′-ATCCGTCTTCATCCTTCTCCT-3′；p62上游引物5′-TGAACCCTCTCGTGGTCGTG-3′，下游引物5′-AAAGCCCCTCTAGGTGGCC-3′；Bcl-2上游引物5′-CACGGTGGTGGAGGAAC-3′，下游引物5′-ACAGCCAGGAGAAATCAAA-3′；β-actin上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。PCR反应体系为20 μL，反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统进行扫描分析。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织病理表现 对照组大鼠肾脏肾小球及肾小管结构无明显变化，肾小管上皮细胞排列整齐。低氟组、高氟组大鼠肾小管上皮细胞有不同程度的水肿，管腔狭窄。高氟组肾小管间质充血更明显。

2.2 各组大鼠肾组织Beclin1、LC3、p62及Bcl-2蛋白表达比较 低氟组、高氟组Beclin1、LC3、p62、Bcl-2阳性表达颗粒位于细胞质内呈棕黄色，与对照组比较，低氟组、高氟组大鼠肾组织中Beclin1、LC3阳性表达数量多，颜色深，且随染氟浓度的升高颜色加深，而p62、Bcl-2阳性表达数量低、颜色浅。详见表1、图1。

表1 各组肾组织Beclin1、LC3、p62、Bcl-2蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低氟组比较，#P<0.05。

注：A为对照组；B为低氟组；C为高氟组。1 为Beclin1；2为 LC3；3为p62；4为Bcl-2。

图1 各组大鼠肾组织Beclin1、LC3、p62、Bcl-2蛋白表达情况(免疫组织化学法，×400)

2.3 各组肾组织Beclin1、LC3、p62及Bcl-2 mRNA表达比较 与对照组比较，低氟组、高氟组肾组织中Beclin1、LC3 mRNA的表达均升高，p62、Bcl-2 mRNA表达均下降(P均<0.05)。高氟组Beclin1、LC3 mRNA表达均高于低氟组，p62、Bcl-2 mRNA表达均低于低氟组(P均<0.05)。详见表2、图2。

表2 各组肾组织Beclin1、LC3、p62及Bcl-2 mRNA表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低氟组比较，﹟P<0.05。

注： M为Marker；1为对照组；2：低氟组；3为高氟组。

图2 各组大鼠肾组织Beclin1、LC3、p62及Bcl-2 mRNA表达情况(RT-PCR法)

3 讨论

地方性氟中毒也称地氟病。地氟病是影响最为广泛的一种全球性的化学性疾病，是由于居住环境出现大剂量氟，通过燃煤、饮水、食物等途径进入机体，引起的一种慢性全身性疾病。受地氟病威胁的面积广、人口多，全国除上海、海南两省无氟中毒流行外，其余省市均有不同程度的流行，主要分布在贵州、四川、山东、辽宁等多个省，主要类型包括饮水型、饮茶型及燃煤污染性三大类。地氟病主要分为骨相损害和非骨相损害两大类，骨相损害是指因氟对骨有较高的亲和性，大剂量氟沉积在骨组织中，导致骨氟含量升高，氟对骨组织代谢紊乱的同时也破坏关节软骨，引起关节退行性改变、关节硬化、软化及骨质增生等病变[4]。非骨相损害方面，肾是受累最严重的非骨相器官之一，因肾是机体主要的排泄器官，约85%的体内氟从肾脏排出，但当过量的氟摄入机体超过肾脏代谢程度时，可致肾小管上皮细胞发生不同程度的水肿、变性，管腔狭窄，肾小球萎缩，影响肾小球的滤过及重吸收功能。

大量的研究表明，凋亡是参与慢性氟中毒肾损伤的机制之一[5,6]。凋亡是由基因调控的一种程序性死亡，在大剂量氟作用下，机体内氧自由基及过氧化物增多，细胞内大剂量的氟使细胞内氧自由基升高，使内质网、线粒体等细胞器处于氧化应激状态，线粒体结构被破坏后释放细胞色素C，激活下游Caspase启动凋亡途径，引起细胞凋亡[7]。也有研究采用电镜下观察慢性氟中毒肾组织时，发现肾小管上皮细胞有巨大线粒体形成，内质网扩张，胞核内异染色质有向核膜下聚集，细胞向凋亡方向发展[8]。Bcl-2是与细胞凋亡最密切的重要抗凋亡基因，其表达可阻断凋亡的发生；Bcl-2能抑制细胞色素C的释放从而抑制Caspase，发挥抗凋亡作用。Bcl-2还与自噬关系紧密，在自噬和凋亡中均有重要作用[9]。

自噬是机体细胞的一种程序性死亡方式，也称为Ⅱ型程序性死亡，参与细胞增殖、生长、凋亡、维持细胞内环境稳态。LC3、p62均为与自噬相关的标志蛋白。LC3为微管相关蛋白1和轻链3，在自噬过程中LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺(PE)以泛素样反应方式结合，向脂质形式LC3-Ⅱ转化，以LC3-Ⅱ的形式稳定存在于自噬内外膜上，其含量与自噬泡数量成正比[10]，用于检测自噬活性。p62又称SQSTM1，是一种多功能的泛素化蛋白，主要在自噬体吞噬蛋白质时发挥重要作用[11]，定位于自噬小体内与LC3-Ⅱ结合形成复合物。研究发现，自噬被激活后，p62蛋白可在细胞质中不断被降解，因此p62是反映自噬活性的标志性蛋白[12]。Beclin1是自噬形成的必须分子，介导自噬相关蛋白定位于自噬泡[13]，主要与Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-Ⅲ)形成复合物，调节自噬相关基因蛋白并参与自噬的过程[14]。研究发现，自噬体双层膜结构的形成是Atg14与Beclin1相互作用的结果，是自噬形成的关键起始阶段[15]。因此，根据自噬相关因子LC3、Beclin1、p62表达情况能精准地反映自噬水平，而Bcl-2可反映凋亡情况。不仅如此，氟介导自噬和细胞凋亡之间存在某种联系，自噬和凋亡关系错综复杂[16]。Beclin1作为自噬的诱导物，被认为是自噬和凋亡的重要桥梁[17]。研究发现，Beclin1上有BH3-only蛋白，而抗凋亡蛋白Bcl-2家族均有BH3的结合域，故Bcl-2与PI3K-Ⅲ可竞争性结合到Beclin1上，影响PI3K-Ⅲ与Beclin1的结合，从而抑制自噬的发生。研究发现，大鼠肾脏内有自噬体形成，而且这种自噬能被Bcl-2所抑制[18]，表明Beclin1及LC3的表达与肾疾病病变程度有关，自噬在肾组织损伤有重要作用[19,20]。自噬保护机体的各种免疫应答，促进细胞生存，是维持机体稳态一种重要的机制，但过度的表达或不当的自噬会加速细胞凋亡。本研究发现，慢性氟中毒大鼠的肾小管上皮细胞内Beclin1、LC3蛋白及mRNA表达较对照组明显升高，p62和Bcl-2蛋白及mRNA则出现低表达，且高氟组Beclin1、LC3蛋白及mRNA表达均高于低氟组，p62、Bcl-2蛋白及mRNA表达均低于低氟组，提示慢性氟中毒时大鼠肾脏中自噬、凋亡同时激活，且其激活程度与氟中毒的程度有关，氟中毒较重时自噬、凋亡激活更加明显。

综上所述，慢性氟中毒后可使大鼠肾组织中自噬和凋亡同时激活，提示自噬和凋亡可能共同参与慢性氟中毒肾损害的发病机制。