芹黄素联合缺血后处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响及机制探讨

刘洋，刘修恒，王磊，陈志远，郭佳，翁小东，杜洋，汪志顺，王敏

(武汉大学人民医院，武汉430060)

缺血再灌注(I/R)损伤是临床常见的病理生理变化，常发生于严重创伤、急性失血、中毒性休克和肾移植术后[1]。由于肾脏具有高灌注的特性，因此肾脏成为对I/R损伤最敏感的器官之一，发生I/R后容易导致急性肾功能衰竭和器官移植后排斥反应的发生。研究发现，肾I/R损伤的机制十分复杂，可能涉及炎症反应、氧自由基产生、ATP生成减少、细胞内钙超载、细胞凋亡等多个途径[2]。缺血后处理(IPO)是指在长时间缺血后，组织或器官再重获多次血流灌注或氧供应的过程，可启动缺血组织和器官的内源性保护机制，进而缓解组织和器官的I/R损伤[3]。IPO能抑制肾I/R损伤诱发的肾组织细胞凋亡，发挥很强的肾保护作用，但机制尚不明确。芹黄素是一种广泛存在于植物体内的天然黄酮类化合物，具有显著的抗癌和抗氧化功能。研究证实，芹黄素对人体多个器官具有保护作用，能够有效抑制细胞凋亡和氧化应激反应[4]。封莎等[5]研究表明，芹黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤有明显的疗效，其机制可能与阻断TLR4/NF-κB通路有关。近年研究发现，不同干预措施的联合应用能够对器官I/R损伤产生更好的治疗效果[6,7]。但目前，对芹黄素与IPO联合处理对肾I/R损伤的治疗效果研究尚较少。2016年5～10月，我们采用芹黄素预处理联合IPO，干预大鼠肾I/R损伤模型，探讨二者联合处理对肾I/R损伤的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康雄性SD大鼠50只，体质量220～300 g，购于湖北省疾病预防控制中心。芹黄素(纯度98%)购于上海阿拉丁试剂有限公司；高迁移率族蛋白1(HMGB1)、NF-κB抗体、TNF-α抗体和细胞间黏附分子1(ICAM-1)抗体均购于美国Santa Cruz公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、模型制备及干预方法 50只大鼠以普通饲料适应性饲养1周后，随机分为假手术组(Sham组)、I/R组、I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组，每组各10只。I/R组、I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组均制备肾I/R模型，暴露两侧肾脏后，分离肾包膜及肾动静脉，切除右肾后使用无损伤血管夹夹闭左肾肾动脉和肾静脉，待肾脏颜色变为暗红色即可确定左肾血流被阻断，45 min后松开动脉夹再灌注，肾脏颜色恢复为鲜红色，即认为血流恢复正常，I/R模型制备成功。其中，I/R组于阻断45 min、再灌注成功后即逐层关闭腹腔；I/R+芹黄素组在I/R前30 min经腹腔注射芹黄素10 mg/kg，然后制备I/R模型；IPO组在制备I/R模型过程中，阻断左肾动脉血流45 min后，给予反复3次的恢复血流10 s、阻断血流10 s的IPO后，再完全恢复肾脏血流供应；芹黄素+IPO组在制备I/R模型前30 min腹腔注射芹黄素10 mg/kg，阻断左肾动脉血流45 min后，再给予反复3次的恢复血流10 s、阻断血流10 s的IPO处理。Sham组暴露两侧肾脏后，仅分离肾包膜及肾动静脉而不阻断血流，切除右肾后逐层关闭腹腔。

1.2.2 血清BUN及Cr水平检测 各组干预24 h后，均经心脏取血4 mL，置于抗凝管中，37 ℃恒温静置4 h，离心分离血清，-70 ℃保存，使用日本Olympus Au2700全自动生化分析仪测定血清BUN及Cr水平。

1.2.3 肾组织病理组织学观察 取血后处死各组大鼠，摘取左肾，40 g/L多聚甲醛固定后制备石蜡切片，行HE染色，置于日本Olympus显微镜下观察病理变化。

1.2.4 肾组织HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1 mRNA表达检测 采用Real time PCR法。TRIzol法提取总RNA，分光光度计检测RNA浓度和纯度。取总RNA 1 μg，逆转录生成cDNA。HMGB1上游引物5′-GCTGACAAGGCTCGTTATGAA-3′，下游引物5′-CCTTTGATTTTGGGGCGGTA-3′；NF-κB上游引物5′-GCAGCACTACTTCTTGACCACC-3′，下游引物5′-TCTGCTCCTGAGCATTGACGTC-3′；TNF-α上游引物5′-CTTCTCATTCCTGCTCGTGG-3′，下游引物5′-TCCGCTTGGTGGTTTGCTAC-3′；ICAM-1上游引物5′-GGGATGGTGAAGTCTGTCAA-3′，下游引物5′-GGCGGTAATAGGTGTAAATGG-3′；以GAPDH为内参照，GAPDH上游引物5′-TCAAGGCTGAGAATGGGAAG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3′。PCR反应条件均为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环，最后一次为72 ℃延伸7 min。最后做融解曲线，检测 PCR 产物的特异性，对样品的 mRNA含量进行定量分析。

1.2.5 肾组织NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表达检测 采用免疫组化法。将保存的肾组织制成4 μm的石蜡切片，使用SP法免疫组化试剂盒进行操作，分别加入NF-κB、TNF-α和ICAM-1抗体及相应二抗，DAB显色、复染、透明、封固，光镜下观察，以细胞质或细胞核内有棕黄色颗粒沉积为阳性，以PBS代替一抗作为阴性对照。所有操作步骤严格按照试剂盒说明书要求进行。结果判断应用HPIAS-1000型医学图像分析系统进行分析，每张标本按顺序选15个肾小球视野，分别检测每个肾小球视野内出现的阳性细胞数，最后以每组的均值作为阳性指数进行比较。

1.2.6 肾组织HMGB1蛋白表达检测 采用Western blot法。取肾组织，剪碎后匀浆，加入裂解液提取蛋白，4 ℃ 12 000 r/min离心取上清，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取20 μg蛋白样品上样，于10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，100 V电转印至PVDF膜上。50 g/L脱脂牛奶封闭2 h，稀释一抗4 ℃孵育过夜。PBS洗膜3次，将辣根过氧化物酶标记的二抗1∶2 000稀释后加入孵育，洗膜后ECL法显色并照相。用凝胶图像分析系统进行半定量分析，以HMGB1/GAPDH比值作为HMGB1相对表达量。

2 结果

2.1 各组血清BUN及Cr水平比较 I/R组、I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组血清BUN及Cr水平均高于Sham组(P均<0.05)；I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组血清BUN及Cr水平均低于I/R组(P均<0.05)；芹黄素+IPO组血清BUN及Cr水平均低于I/R+芹黄素组及IPO组(P均<0.05)。I/R+芹黄素组与IPO组血清BUN及Cr水平差异均无统计学意义(P均>0.05)。详见表1。

2.2 各组肾组织病理学改变 Sham组肾小管排列整齐，管腔内无红细胞，肾小管未见明显的形态学改变。I/R组肾小管上皮细胞肿胀，部分细胞明显变性坏死，界限不清，肾小管明显扩张，管腔内可见细胞管型。与I/R组相比，芹黄素+IPO组、I/R+芹黄素组和IPO组肾小管损伤程度明显减轻，有少量肾小管上皮细胞轻度水肿、空泡变性，管型少见，有少量炎性细胞浸润。见图1。

表1 各组血清BUN及Cr水平比较

注：与Sham组比较，*P<0.01；与I/R组比较，#P<0.05；与芹黄素+IPO组比较，△P<0.05。

2.3 各组肾组织HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1 mRNA表达比较 I/R组、I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表达均高于Sham组(P均<0.01)；I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表达均低于I/R组(P均<0.05)；芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表达均低于I/R+芹黄素组及IPO组(P均<0.05)。见表2。

注：A为Sham组；B为I/R组；C为I/R+芹黄素组；D为IPO组；E为芹黄素+IPO组。

图1 各组大鼠肾组织病理学染色结果(HE染色，×400)

2.4 各组肾组织HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表达比较 I/R组、I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表达均高于Sham组(P均<0.01)；I/R+芹黄素组、IPO组、芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表达均低于I/R组(P均<0.05)；芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1蛋白表达均低于I/R+芹黄素组及IPO组(P均<0.05)。见表3、图2。

表2 各组肾组织HMGB1、NF-κB、TNF-α及ICAM-1 mRNA表达比较

注：与Sham组比较，*P<0.01；与I/R组比较，#P<0.05；与芹黄素+IPO组比较，△P<0.05。

表3 各组HMGB1蛋白表达比较

注：与Sham组比较，*P<0.01；与IR组比较，#P<0.05；与芹黄素+IPO组比较，△P<0.05。

注：1为Sham组；2为I/R组;3为I/R芹黄素组；4为IPO组;5为芹黄素+IPO组。

图2 各组肾组织HMGB1蛋白表达情况(Western blot法)

3 讨论

肾脏血供丰富、结构特殊，因此对I/R损伤极其敏感。肾I/R损伤常发生于肾移植和创伤后休克等过程中，极易诱发急性肾损伤，甚至造成急性肾功能衰竭[8]。肾I/R损伤的预防和治疗已逐渐成为当今研究的热点。肾I/R的治疗方法主要包括缺血预处理、IPO、药物预处理、药物后处理以及联合治疗等。IPO指组织器官在I/R时一系列间断、反复获得血流灌注的过程[9]。研究表明，IPO能有效减少肾I/R后组织细胞的损伤，其机制可能与氧自由基和各种炎症因子的减少、内皮素活性降低、NO等保护性物质的产生、I/R损伤补救酶(RISK)途径被激活等有关[10, 11]。本研究发现，I/R组血清BUN及Cr水平均高于Sham组，病理表现为肾小管上皮细胞肿胀，部分细胞明显变性坏死，肾小管明显扩张，管腔内可见细胞管型，提示发生I/R损伤后肾组织损伤严重；IPO组血清BUN及Cr水平均低于I/R组，肾小管损伤程度明显减轻，提示IPO能有效地减轻I/R对肾脏组织的损伤，肾功能明显好转。但是，IPO因操作有创、时机的选择、术后危险性和不可预知性等原因，其临床应用受到诸多限制。因此，寻找简单易行安全可靠的干预措施逐渐成为研究热点。将IPO与其他方法相结合，以弥补单一方法对I/R损伤治疗效果的不足，这将成为肾I/R损伤治疗中的一个新方向。

芹黄素是从植物中提取的天然单体活性成分，属于多酚类物质。研究表明，芹黄素具有抗氧化、抗肿瘤、防止细胞衰老的作用，并且对心脏、肝脏组织的I/R损伤有一定的疗效[12]。张慧芝等[13]研究表明，NF-κB及ICAM-1均参与了心肌I/R损伤过程，而芹菜素能够抑制NF-κB的活性，降低I/R损伤后炎症因子ICAM-1的表达，其机制可能与抑制各类炎症因子的表达和释放有关。然而，芹黄素预处理存在缺血时间的不确定性，在临床应用上容易产生局限性，IPO虽然具有可控性，但其保护效果不及联合处理。芹黄素预处理和缺血后处理在治疗肾I/R损伤的机制上具有一定的相似性，两者的联合干预或许可以发挥协同的保护效应。本研究发现，I/R+芹黄素组血清BUN及Cr水平均低于I/R组，肾小管损伤程度较I/R组明显减轻，提示芹黄素预处理能够使I/R损伤大鼠的血清BUN和Cr水平显著降低，减轻肾功能病理损伤；芹黄素+IPO组血清BUN及Cr水平均低于I/R+芹黄素组及IPO组，肾组织损伤程度明显减轻，提示芹黄素预处理联合IPO能够更有效地减轻肾I/R损伤，促进肾功能明显好转。

HMGB1是一种广泛存在于真核细胞内、高度保守的非组织核蛋白，是一种强大的致炎细胞因子，可由免疫细胞在炎症因子的刺激下主动分泌，主要参与DNA重组修复、核小体构建、基因转录等过程，是一种重要的晚期炎性介质，参与各种炎症过程[14]。近年来研究表明，HMGB1参与了心、脑、肝、肾等重要脏器的I/R损伤过程[15]。Chung等[16]研究发现，抑制HMGB1分泌和释放可能有助于减轻肾脏I/R损伤。HMGB1与其受体晚期糖基化终末产物受体(RAGE)相互作用，激活ERK激酶、P38MAPK激酶和c-Jun激酶，并间接地导致核转录因子NF-κB出现核移位[17]。此外，HMGB1也能够促进TNF-α、ICAM-1和IL-1等炎性介质的表达，引起白细胞的过度聚集，从而导致炎症损伤反应的加重[18]。NF-κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链启动子κB位点结合的核因子，存在于各类细胞的细胞质中，是多种信号传导通路的常见转录因子，被激活的NF-κB能够介导多种炎性介质的表达，如TNF-α、ICAM-1等，并引起多形核白细胞的聚集黏附，最终导致肾I/R后炎症反应以及继发性肾脏组织损害[19]。肾脏发生I/R损伤后，机体产生应激反应，生成大量的细胞因子和炎性介质，从而激活中性粒细胞和血管内皮细胞并表达ICAM-1。ICAM-1是介导中性粒细胞黏附浸润的最重要因素之一，其高表达能够刺激中性粒细胞与内皮细胞的黏附作用，加剧肾脏组织的损伤。本研究发现，I/R组HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表达均高于Sham组，提示大鼠肾脏发生I/R后产生大量的炎症因子，HMGB1、NF-κB、ICAM-1、TNF-α明显上调，导致肾组织出现炎症损伤反应。

封莎等[5]研究表明，芹黄素能够降低脑I/R模型大鼠血清TNF-α、IL-6水平，抑制Toll样受体4和NF-κB的表达，认为芹黄素对I/R损伤的保护机制可能与抑制TLR4、NF-κB以及炎症因子的表达有关。研究证实，芹黄素能够阻断HMGB1与其受体RAGE的结合，并抑制NF-κB的激活所导致的促炎作用。因此，芹黄素能够下调HMGB1-RAGE-NF-κB的表达来减少炎症反应的发生。本研究发现，芹黄素+I/R组HMGB1、NF-κB、TNF-α、ICAM-1 mRNA表达均低于I/R组，提示肾I/R损伤后芹黄素能够明显抑制肾组织炎症反应；芹黄素+IPO组HMGB1、NF-κB、TNF-α和ICAM-1 mRNA表达均低于I/R+芹黄素组及IPO组，提示芹黄素预处理联合IPO的基础上联合的干预方案，能够更为有效地抑制肾缺血再灌注损伤后的炎症反应，比芹黄素预处理或IPO的单一治疗更加安全有效，可能为芹黄素预处理联合IPO能够减轻肾I/R损伤的机制之一。