不同浓度氧暴露对早产儿外周血单个核细胞SIRT1通路的影响

刘兴铃，董文斌，李清平，雷小平，张莲玉，卢佑英，赵帅

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

胎龄<37周出生的活产婴儿称为早产儿或未成熟儿。由于早产儿肺脏发育常不成熟，多需要进行呼吸支持，而随着机械通气和吸氧治疗(以下简称氧疗)时间的延长，可导致早产儿视网膜病甚至早产儿支气管肺发育不良(BPD)的发生[1]。活性氧簇(ROS)是细胞线粒体呼吸过程中产生的一个导致氧化损伤和老化的破坏性产物，是氧化应激反应过程中的重要指标。本课题组前期研究证实[2]，高浓度的氧暴露可诱导早产儿外周血单个核细胞(PBMCs)中产生大量的ROS，促进氧化应激反应的发生，但其机制尚不明确。沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)是一种应激反应性分子，作为底物参与SUMO化反应，发挥其去乙酰化的保护作用，避免氧化应激等损伤[3]。SUMO特异性蛋白酶家族(SENPs)参与SUMO蛋白共价结合(被切断)到靶蛋白赖氨酸残基上的动态可逆过程，目前研究较多的是SENP1， SIRT1又可以被SENP1去SUMO化，抑制SIRT1的去乙酰化活性[3]。p53是SIRT1的非组蛋白底物，乙酰化p53的促凋亡作用可以被SIRT1的去乙酰化作用缓解，达到抑制凋亡的作用[4]。目前，对SIRT1信号通路在高氧对低体质量早产儿氧化应激损伤中的作用尚不清楚。2015年6月～2016年7月，我们对80例低体质量早产儿采用不同浓度氧疗，观察PBMCs内SIRT1通路相关蛋白的表达变化，探讨氧暴露对早产儿氧化应激损伤的影响及其机制，为BPD的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 试剂及仪器 人淋巴细胞分离液(灏洋生物制品科技有限责任公司)；MitoSOXTMRed(Invitrogen公司)；DAPI(北京索莱宝公司)；抗荧光淬灭封片剂(碧云天公司)；兔抗人SIRT1抗体(Abcam公司)；二抗羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG(Abcam公司)；5×SDS上样缓冲液(上海生工)；蛋白裂解液(美国碧云天公司)；内参一抗(Abcam公司)；牛血清白蛋白(Amersham Pharmacia Biotech公司，美国)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)等。低温高速离心机GS-15R(Beckman公司)；超净工作台(Thermo公司)；倒置相差显微镜(Olympus公司)；TCSSP5激光共聚焦显微镜(Leica公司)；全光谱分光光度仪(Eppendorf公司)；GDS8000凝胶扫描系统(UVP公司)。

1.2 临床资料 选取2015年6月～2016年7月生后即入住我院新生儿科的低体质量早产儿80例，男44例、女36例，胎龄(29.82±0.79)周，入院时间为生后(4.51±2.21)h，出生体质量(1 152±117)g。纳入标准：胎龄<32周；出生体质量<1 500 g[11]；入院时诊断为新生儿呼吸窘迫综合征且需要立即氧疗；出生24 h内入院且存活至生后住院时间28 d以上。排除标准：合并复杂型先天性心脏病及其他先天畸形。按氧暴露水平进行前瞻性队列分组，根据吸氧浓度分为对照组、低浓度吸氧组、中浓度吸氧组、高浓度吸氧组各20例。四组患儿性别、胎龄、出生体质量差异无统计学意义，具有可比性。本研究经我院伦理委员会批准，征得家属同意并签署知情同意书。

1.3 氧疗方法 四组均于出生后即开始进行氧疗，采用低氧无创CPAP辅助通气或有创呼吸机机械通气(气管插管)。对照组吸氧浓度FiO2=21%或以FiO2>21%吸氧，但总吸氧时间<24 h；低浓度吸氧组FiO2>21%，吸氧时间>24 h，或因病情需要FiO2>30%的吸氧时间<24 h；中浓度吸氧组FiO2为30%～<40%，吸氧时间>24 h，或因病情需要FiO2>40%的吸氧时间<24 h；高浓度吸氧组为FiO2≥40%且吸氧时间>24 h。

1.4 实验方法

1.4.1 PBMCs分离 分别于生后0、7、14、28 d时，均经桡动脉采血2 mL，置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs。

1.4.2 PBMCs中ROS水平检测 采用激光共聚焦显微镜技术。将分离出的PBMCs调整细胞数为2×106/mL。取200 μL细胞悬液小心均匀涂于黏附载玻片上待干；滴加40 g/L多聚甲醛固定20 min，按说明书配制Mito SOX探针，滴加800 μL均匀覆盖于细胞层上，37 ℃湿盒孵育30 min。取10 μg/mL DAPI 80 μL蓝色荧光染料染细胞核5 min，滴加20 μL抗荧光淬灭剂封片。采用激光共聚焦显微镜检测红色荧光(激发波长510 nm、发射波长580 nm)，采用Image Pro Plus6.0图像分析软件对图像进行分析处理，测定平均荧光强度，从而反映ROS水平。

1.4.3 PBMCs中SIRT1定位检测 采用激光共聚焦显微镜技术。细胞涂片和固定同上，滴加80 μL 0.2%TritonX-100室温下穿透细胞15 min，滴加正常山羊血清工作液，滴加抗体稀释液稀释的兔抗人SIRT1抗体(1∶80)， 4 ℃孵育过夜。避光滴加FITC记山羊抗小兔IgG(1∶800)，37 ℃孵育1 h。DAPI染核，抗荧光淬灭剂封片，用激光共聚焦显微镜检测红色荧光(激发波长488 nm)，反映SIRT1定位情况[12]。DAPI染细胞核标记蓝色荧光，两种荧光合成为紫色荧光。运用Image Pro Plus 中的line profile测定细胞内紫色荧光强度分布，出现荧光强度向靠近胞膜侧增高而在胞核中降低的细胞即为发生SIRT1转位的阳性细胞。取8个视野，以阳性细胞数占细胞总数的构成比计算转位率。

1.4.4 PBMCs内胞核SIRT1蛋白表达检测 采用Western blot法。悬浮细胞离心，弃上清留下细胞沉淀，PMSF的细胞质蛋白抽提试剂A，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰浴；加入细胞质蛋白抽提试剂B 10 μL，得到细胞质蛋白。添加PMSF细胞核蛋白抽提试剂，震荡、离心后得到细胞核蛋白。SDS-PAGE电泳、封闭，取出聚偏二氟乙烯膜，显影后晾干。采用UVP凝胶图像处理系统Lakworks4.6软件分析目的条带的灰度值，结果以胞核SIRT1/GAPDH表示。

1.4.5 PBMCs内SENP1、乙酰化p53蛋白表达检测 采用Western blot法。淋巴细胞分离，收集细胞离心，加入细胞裂解液(RIPA)，充分振荡，离心吸取上清，Bradford方法蛋白定量后加入等体积2×上样缓冲液，煮沸5 min，短暂离心后-20 ℃保存。取50 μg蛋白样品行8% SDSPAGE电泳。用湿转法将胶上蛋白转移至NC膜上，加入鼠源一抗，4 ℃过夜后，加入HRP标记的兔抗鼠二抗。缓冲液冲洗后，进入暗室，显影、晾干后，采用UVP凝胶图像处理系统Lakworks4.6软件分析目的条带的灰度值，结果以SIRT1、乙酰化p53与GAPDH的比值表示蛋白表达量。

2 结果

2.1 各组不同时间PBMCs中ROS水平比较 低、中、高浓度吸氧组各时点PBMCs中ROS水平均高于对照组，中、高浓度吸氧组各时点ROS水平均高于低浓度吸氧组，高浓度吸氧组各时点ROS水平均高于中浓度吸氧组(P均<0.05)；在各时点，PBMCs中ROS水平随氧浓度增高而增高(F= 889.085，P<0.01)。生后7、14、28 d时各吸氧组PBMCs中ROS水平均高于生后0 d，生后14、28 d时各吸氧组PBMCs中ROS水平均高于生后7 d，生后28 d各吸氧组PBMCs中ROS水平均高于生后14 d(P均<0.05)；各吸氧组PBMCs中ROS水平随氧疗时间增加而增高(F=368.535，P<0.01)。吸氧浓度和时点有交互效应(F=177.832，P<0.01)，随着时间的变化，不同氧浓度组各时点PBMCs中ROS的生成量变化趋势不同。随着吸入氧浓度的程度增加、生后时间的延长，ROS水平增加。见表1。

表1 各组不同时间PBMCs中ROS水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度吸氧组比较，△P<0.05；与中浓度吸氧组比较，#P<0.05；与同组生后0 d比较，aP<0.05；与同组生后7 d比较，bP<0.05；与同组生后14 d比较，cP<0.05。

2.2 各组PBMCs中SIRT1定位 低、中、高浓度吸氧组各时点PBMCs中SIRT1转位率均高于对照组，中、高浓度吸氧组各时点SIRT1转位率均高于低浓度吸氧组，高浓度吸氧组各时点SIRT1转位率均高于中浓度吸氧组(P均<0.05)。生后7 d、生后14 d、生后28 d各吸氧组PBMCs中SIRT1转位率均高于生后0 d，生后14 d、生后28 d各吸氧组PBMCs中SIRT1转位率均高于生后7 d，生后28 d各吸氧组PBMCs中SIRT1转位率均高于生后14 d(P均<0.05)。吸氧浓度和时点有交互效应(F=347.299，P<0.01)，随着吸入氧浓度的浓度增加及生后时间的延长，SIRT1转位率增加。见表2。

表2 各组PBMCs中SIRT1转位率比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度吸氧组比较，△P<0.05；与中浓度吸氧组比较，#P<0.05；与同组生后0 d比较，aP<0.05；与同组生后7 d比较，bP<0.05；与同组生后14 d比较，cP<0.05。

2.3 各组PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达比较 低、中、高浓度吸氧组除生后0 d外，其余时点上PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达均低于对照组(P均<0.05)，中、高浓度吸氧组除生后0 d外，其余时点PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达均低于低浓度吸氧组(P均<0.05)，高浓度吸氧组生后7 d、生后14 d、生后28 d的PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达均低于中浓度吸氧组(P均<0.05)。与生后0 d比较，生后7 d各吸氧组的PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达均无明显改变(P均>0.05)，生后14、28 d各吸氧组PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达均低于生后7 d(P均<0.05)，生后28 d的各吸氧组PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达均低于生后14 d(P均<0.05)。吸氧浓度和时点有交互效应(F=3.117，P<0.05)，随着吸入氧浓度的浓度增加及生后时间的延长，SIRT1转位率增加。见表3。

表3 各组PBMCs中胞核SIRT1蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度吸氧组比较，△P<0.05；与中浓度吸氧组比较，#P<0.05；与同组生后0 d比较，aP<0.05；与同组生后7 d比较，bP<0.05；与同组生后14 d比较，cP<0.05。

2.4 各组PBMCs中SENP1蛋白表达比较 中、高浓度吸氧组除生后0 d外，其余时点PBMCs中SENP1蛋白表达均高于低浓度吸氧组(P均<0.05)，高浓度吸氧组生后7、14、28 d的PBMCs中SENP1蛋白表达均高于中浓度吸氧组(P均<0.05)。中、高浓度吸氧组生后14、28 d的PBMCs中SENP1蛋白表达均高于生后7 d(P均<0.05)，中、高浓度吸氧组生后28 d的PBMCs中SENP1蛋白表达均高于生后14 d(P均<0.05)。吸氧浓度和时点有交互效应(F=7.400，P<0.05)，随着吸入氧浓度的增加及生后时间的延长，SENP1蛋白表达增加。见表4。

表4 各组PBMCs中SENP1蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度吸氧组比较，△P<0.05；与中浓度吸氧组比较，#P<0.05；与同组生后0 d比较，aP<0.05；与同组生后7 d比较，bP<0.05；与同组生后14 d比较，cP<0.05。

2.5 各组PBMCs中乙酰化p53蛋白表达比较 中、高浓度吸氧组各时点PBMCs中乙酰化p53蛋白表达均高于低浓度吸氧组(P均<0.05)，高浓度吸氧组各时点PBMCs中乙酰化p53蛋白表达均高于中浓度吸氧组(P均<0.05)。生后7、14、28 d的中、高浓度吸氧组的PBMCs中乙酰化p53蛋白表达均高于生后0 d(P均<0.05)，生后14、28 d的中、高浓度吸氧组PBMCs中乙酰化p53蛋白表达均高于生后7 d(P均<0.05)，生后28 d的中、高浓度吸氧组PBMCs中乙酰化p53蛋白表达均高于生后14 d(P均<0.05)。吸氧浓度和时点有交互效应(F=8.6037，P<0.05)，随着吸入氧浓度的浓度增加及生后时间的延长，乙酰化p53蛋白增加。见表5。

表5 各组PBMCs中乙酰化p53蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低浓度吸氧组比较，△P<0.05；与中浓度吸氧组比较，#P<0.05；与同组生后0 d比较，aP<0.05；与同组生后7 d比较，bP<0.05；与同组生后14 d比较，cP<0.05。

3 讨论

近年来，随着产前糖皮质激素的应用、生后呼吸支持技术的发展、新生儿重症监护病房的建立等，极早早产儿、极低体质量儿存活率明显提高[5]。但由于早产低体质量儿肺处于发育不成熟的阶段，肺表面活性物质分泌不足、肺顺应性低，故生后早期就有氧疗指征，常需行机械通气及氧疗，置于长时间用氧环境中[6]。但氧疗在提高存活率的同时，由于早产儿各系统发育不成熟，高浓度氧疗可导致氧损伤或氧中毒，其最常见的并发症是肺损伤。发生氧中毒时，可直接损伤肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞，使肺泡毛细血管通透性增加，最终可诱发早产儿BPD的产生[7]。目前，对长时间及高浓度氧疗导致的氧损伤机制尚不明确。

研究发现，氧化应激反应在高氧肺损伤中起着重要作用，氧化应激时线粒体的ROS生成增加，当累积超过正常生理水平时，会损伤线粒体内膜及DNA，影响线粒体的生物合成，破坏氧化呼吸链NAD+与NADH的相互转换[8]。研究证明，当高氧暴露后，由于这类早产儿肺发育极不成熟，缺乏抵抗氧化应激的能力，高氧诱导的大量ROS不能被机体抗氧化应激酶所清除，造成氧化应激损伤，甚至这些ROS会上调促凋亡蛋白的表达，激活Casepse凋亡途径，导致高氧肺损伤[9]。本研究发现，吸氧浓度和时点有交互效应，说明随着时间的变化，不同氧浓度组各时点PBMCs中ROS的生成量变化趋势不同，故PBMCs中ROS水平随氧浓度的增高而增高，各吸氧组PBMCs中ROS水平随氧疗时间的增加而增高。

SIRT1是一种依赖酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶，正常生理情况下，SIRT1可维持足够的NAD+，对活性氧簇的产生具有抑制作用。SIRT1在哺乳动物细胞质和细胞核中均有表达，尤以细胞核为主，细胞核较细胞质明显多，并且核内SIRT1亚细胞定位受Ⅱ类去乙酰化酶核-浆穿梭中机制调节，与细胞增殖、分化、衰老、凋亡和代谢密切相关。Yang等[10]研究发现，人类SIRT1蛋白在生理调节下定位于细胞核。有研究显示[11]，在细胞核中SIRT1表达是抗凋亡作用，而在细胞质内是促凋亡作用，所以核内SIRT1在机体损伤后升高显得更加有保护意义。随着ROS升高，会使生物膜脂质氧化，膜的正常结构发生破坏后，膜的通透性和流动性发生改变，导致SIRT1发生核质穿梭，细胞核中SIRT1减少，其在胞核中发挥的去乙酰化作用减弱，对细胞的保护性作用减弱，并且转移到细胞质的SIRT1是促凋亡因子。本课题组前期研究发现，高氧可诱导ROS产生增加，使SIRT1发生核质穿梭[2]。本研究发现，在免疫荧光检测中，SIRT1的转位率，在吸氧浓度和时点有交互效应，提示随着吸氧浓度的增加、生后时间延长SIRT1发生核-质穿梭的细胞数也增加，会出现去乙酰化作用减弱，与SIRT1结合的组蛋白，发生乙酰化反应，会启动参与细胞损伤的过程。并且也发现，SIRT1蛋白在细胞核的表达在在吸氧浓度和时点有交互效应，说明随着吸氧浓度增加、生后时间的延长， ROS增加，细胞氧化应激程度加重，脂质氧化后通透性增加，各吸氧组各时点PBMCs中SIRT1蛋白发生转位后，在细胞核表达减少，而细胞质中表达逐渐增多，细胞损伤进行性加重。

SENPs在哺乳动物细胞中有6个成员，目前研究较多的是SENP1。SIRT1是SUMO的底物蛋白，能被SUMO化修饰，形成SIRT1/SUMO蛋白复合物，参与应对抗凋亡等保护作用[12]。研究证实[3,13]，当细胞受到氧化应激等刺激时，SENP1不仅参与SUMO化可逆过程，还参与催熟SUMO-1前体，参与SUMO化反应，一方面，SUMO化修饰SIRT1是SUMO-1，SENP1参与该动态反应的过程，另一方面，SIRT1又可以被SENP1去SUMO化，因此，SIRT1的去乙酰化活性会受到抑制。本研究结果显示，吸氧浓度和时点有交互效应，说明随着生后时间的变化，不同吸氧浓度组各时点PBMCs中SENP1蛋白表达不同。随着吸入氧浓度的浓度增加及生后时间的延长，SENP1蛋白表达增加,提示随着SENP1的升高，发生去SUMO化和SUMO化反应的失衡，SIRT1/SUMO蛋白复合物解体，下调SIRT1的去乙酰化作用，SIRT1也将发生核质穿梭。

SIRT1可以通过去乙酰化作用于靶蛋白如p53、FOXO家族等，发挥其抗氧化应激、抗炎、抗凋亡等保护细胞的作用[3]。研究表明，SIRT1多作用于p53的第373和382赖氨酸位点，SIRT1可能使p53在第373和382赖氨酸位点去乙酰化，进而通过抑制p53的转录活性，从而阻止氧化应激诱导的细胞凋亡。乙酰化p53的促凋亡作用可以被SIRT1的去乙酰化作用缓解，达到抑制凋亡的作用[10]。本研究结果发现，与对照组相比，在低浓度吸氧组生后7 d时，细胞乙酰化p53的表达并无差异，这可能是机体p53蛋白保护作用并未失衡；此外，吸氧浓度和时点有交互效应，说明随着生后时间的变化，不同吸氧浓度组各时点PBMCs中乙酰化p53蛋白表达不同;随着吸入氧浓度的浓度增加及生后时间的延长，乙酰化p53蛋白增加,表明氧化应激过度时，SENP1改变，胞核SIRT1发生转位后，SIRT1去乙酰化作用受到抑制，相应地，乙酰化p53升高。

综上所述，随着氧暴露的程度增加及生后时间的延长，ROS表达超过机体清除能力，发生氧化应激,一方面导致脂质膜通透性发生改变，另一方面使SENP1参与的SUMO化动态可逆过程受到抑制，SIRT1核质穿梭更加明显，胞核SIRT1去乙酰化降低，损伤因子乙酰化p53表达增加，最终导致氧化应激损伤。此外，SUMO化SIRT1的改变是否受到氧暴露的时间影响，机制尚不清楚，是否还受到其他位点蛋白的参与调控等均待进一步研究证明。