乌梅提取物对纳米细菌致大鼠肾结石形成的影响及机制探讨

刘淼，谷江，张永春，夏剑锋，杨锦春，董安涛

(贵州医科大学附属医院，贵阳550004)

肾结石是一种以间歇性肾绞痛和血尿为主要表现的疾病，发病率、复发率高，对肾功能危害大，严重危害人群健康。从肾结石成分来看，肾结石主要以含钙结石为主，其中又以草酸钙结石最多。既往研究认为，钙盐沉积、肾钙斑沉积可能与肾结石的发生与发展有关[1]。近年研究发现，纳米细菌(NB)在95%的肾结石患者血液中检测到，是肾结石形成的起始核心[2]。在人体内，NB可利用机体血液中的钙源发挥生物矿化作用，与炎性介质、基质蛋白一起形成早期肾结石的晶核，进而导致结石的形成[3]。乌梅是由蔷薇科植物梅的干燥近成熟果实加工而成，其主要化学成分为有机酸、黄酮、萜类、甾醇等[4]，其中高富含量的柠檬酸、苹果酸、丁二酸等，对泌尿系结石的形成具有有效拮抗作用[5,6]。但乌梅对NB导致肾结石形成的影响及作用机制尚不明确。2015年2月～2016年9月，我们采用NB建立了大鼠肾草酸钙结石模型，探讨乌梅提取物对NB所致肾草酸钙结石形成的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 8周龄雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，由贵州医科大学动物中心提供。乌梅提取物购自西安赛奥生物技术有限公司；8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)测试盒、丙二醛(MDA)试剂盒、柠檬酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所；PCR扩增试剂盒及引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 NB分离、培养及制备

1.2.1 标本采集 选择2015年2月～2016年6月于我院泌尿外科行开放手术取石的肾结石患者16例，男9例、女7例，年龄32～49岁，排除感染、内分泌疾病、多系统结石等患者。术中无菌采集结石标本，并保存于-80 ℃低温冰箱。将结石放置于1 mol/L HCl中去矿物质处理，然后PBS中和、洗涤，碾碎成粉末状，20 000 r/min离心40 min后，经0.22 μm的滤头加压过滤，收集滤过液。

1.2.2 NB的培养及制备 取处理后的结石滤过液1 mL，加入含10%热灭活γ-胎牛血清(γ-FBS)的PMBI1640，30 d换液一次，培养条件为37 ℃、pH 7.4、5%CO2、95%空气。培养4周后，培养管底部出现白色菌群沉淀，弃去培养管中的培养液，留取管底部分，彻底混匀后，移入离心管中，加入适量生理盐水，4 ℃离心40 min，去上清。沉淀中加入1 mol/L HCl 0.5 mL混匀，37 ℃放置30 min；加入Tris中和，4 ℃离心40 min，留沉淀，配制为NB混悬液备用。经RT-PCR反应鉴定NB中16s rRNA基因，PCR扩增产物电泳可见1 409 bp处出现目的片段，确定NB培养成功。

1.3 动物分组及模型建立 30只大鼠随机分为A、B、C、D、E组各6只。A组第1天以尾静脉一次性注射生理盐水1 mL作为正常对照，B、C、D、E组均于第1天以尾静脉一次性注射NB混悬液1 mL制备大鼠肾结石模型。

1.4 干预方法 A、B组第2天起均以生理盐水2 mL/d灌胃，C、D、E组第2天起分别以0.05、0.10、0.15 g/mL乌梅提取物2 mL/d灌胃。各组大鼠均灌胃干预4周。

1.5 尿液草酸(Ox)、钙(Ca2+)、柠檬酸、8-OHDG水平测定 各组干预4周后，用代谢笼收集24 h尿液，应用高锰酸钾褪色法测定尿液Ox 水平，全自动生化仪测定尿液Ca2+水平，柠檬酸试剂盒测定尿液柠檬酸水平，8-OHDG测试盒以及酶标仪测定尿液8-OHDG水平。

1.6 肾组织草酸钙结晶形态观察及结晶量分级评分 收集尿液次日，乙醚麻醉大鼠，纵向剖开双肾，取左侧肾脏，用10%甲醛固定，石蜡包埋，3 mm切片，行HE染色观察肾组织草酸钙结晶形态。计数平均每个高倍视野内大鼠左肾草酸钙结晶数量。评判标准为肾脏剖面结晶量分级：0级为无结石、结晶形成；1级为少量结石、结晶形成，每个视野3个以下；2级为较多结石、结晶形成，每个视野3～5个；3级为较多结石、结晶形成，每个视野6～10个；4级为大量结石、结晶形成，每个视野10个以上，甚至结石、结晶成团，堵塞肾小管。将0～4级分别记为 1、2、3、4、5分。

1.7 肾组织MDA水平检测 采用硫代巴比妥酸法。取右肾皮质研磨制成10%的匀浆，保存于PBS中，离心取上清，应用MDA试剂盒检测肾组织MDA水平。

2 结果

2.1 各组尿液Ox、Ca2+、柠檬酸、8-OHDG水平比较 B组尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均高于A组，柠檬酸水平低于A组(P均<0.05)。C、D、E组尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于B组，柠檬酸水平均高于B组(P均<0.05)。D、E组尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于C组，柠檬酸水平均高于C组(P均<0.05)。E组尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于D组，柠檬酸水平均高于D组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组尿液Ox、Ca2+、柠檬酸、8-OHDG水平比较

注： 与A组比较，*P<0.05；与B组比较，﹟P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与D组比较，▲P<0.05。

2.2 各组肾组织草酸钙结晶形态及结晶量评分比较 A组无草酸钙结晶，B组草酸钙结晶明显较多，C、D、E组草酸钙结晶数量较B组明显减少。见图1。A、B、C、D、E组草酸钙结晶量评分分别为(1.00±0)、(4.83±0.40)、(3.83±0.41)、(3.00±0.63)、(2.50±0.84)分，B、C、D、E组草酸钙结晶量评分均高于A组，C、D、E组草酸钙结晶量评分均低于B组(P均<0.05)。

图1 各组肾组织草酸钙结晶形态(HE染色，×200)

2.3 各组肾组织MDA水平比较 A、B、C、D、E组肾组织MDA水平分别为(3.41±0.05)、(3.95±0.15)、(3.90±0.04)、(3.68±0.10)、(3.55±0.07)分，B、C、D、E组MDA水平均高于A组，D、E组MDA水平均低于B组(P均<0.05)。

3 讨论

肾结石是泌尿外科最常见的疾病之一。近年来，肾结石在我国的发病率呈上升趋势，5%～15%的人一生中会罹患肾结石，其中约80%为草酸钙肾结石。草酸钙肾结石的形成学说有多种观点，包括肾钙斑形成、过饱和结晶、抑制物缺乏、免疫损伤等[7]。

NB为革兰阴性菌，广泛存在于自然界的矿物质中和生物体内，可耐高温、强酸等。近年研究发现，NB具有特殊的生物矿化能力，能在菌体周围产生羟磷灰石碳酸盐结晶，从而导致结石的形成[6]。NB在pH7.4的生理性钙磷水平中能形成羟基磷灰石碳酸盐结晶，产生坚硬的矿化外壳覆盖于菌体周围。此外，NB可聚集环境中的钙离子并形成矿化纳米颗粒，作为活性中心，黏附、侵入并破坏肾集合管的上皮细胞和肾乳头细胞，形成磷灰石晶核，从而诱发结石形成[8]。本研究发现，B组肾组织草酸钙结晶量评分均高于A组，肾组织草酸钙结晶明显较多，提示NB能够促进大鼠肾草酸钙结晶、结石的形成。因此，抑制NB的生物矿化作用，对于抑制大鼠肾草酸钙结晶、结石的形成具有重要意义。

乌梅是一种安全性高的药食同源药材，其药理作用广泛，在抑菌、抗肿瘤、抗变态反应、抗氧化、治疗结肠炎方面具有明显作用。王萍等[9]研究发现，乌梅含有柠檬酸、苹果酸、酒石酸、天冬氨酸、熊果酸等能明显抑制结石形成的有机酸，各有机酸的协同作用能与Ca2+螯合，降低结石形成的风险。柠檬酸是乌梅有机酸中的主要成分，占乌梅有机酸总量的19%，较Ox而言，柠檬酸能优先螯合Ca2+形成可溶性盐并抑制草酸钙结晶形成[10]，有实验已证实柠檬酸及柠檬酸盐在体外可抑制一水草酸钙的形成及聚集[9]。本研究发现，与B组相比，C、D、E组尿液肾组织草酸钙结晶数量及评分均明显降低，尿液柠檬酸水平均明显增高，提示乌梅提取物可使肾结石大鼠的草酸钙结晶明显减少，随着乌梅提取物干预浓度的增加，结晶结石级别逐渐下降，尿柠檬酸的排泄逐渐增加，表明乌梅能有效抑制NB的矿化作用，减少大鼠草酸钙结晶、结石的形成。

Ox是一种简单的二羟基酸，是很多动、植物和微生物的一种代谢终产物，在动物体内常以盐的形式存在，在自然界中最普通的形式是草酸钙。研究发现，尿液中轻微的Ox超载即比严重的钙超载对草酸钙形成的影响更明显[11]。近期研究表明，肾小管上皮细胞暴露于Ox将会产生细胞膜表面性质改变、线粒体功能中断、活性氧(ROS)形成等毒性反应，而高Ox诱导的高活性氧水平进一步导致氧化还原失衡、脂质过氧化，导致肾脏炎性反应发生、细胞膜完整性丧失以及肾上皮组织损伤，继而利于晶体在细胞膜上黏附以及结晶在肾组织内的聚集[12]，同时Ox超载诱导的肾小管上皮细胞膜完整性的丧失将引起肾小管重吸收障碍，导致肾钙的泄漏，表现为尿钙排泄量的增多[10,13]。ROS作用于细胞核中DNA后可发生过氧化反应，导致DNA-蛋白交联、嘌呤氧化等许多化学修饰，引起DNA氧化损伤，使羟基自由基从稳定的生物分子如蛋白质和代谢物中获取电子和H+，导致碱基修复系统损伤，产生错误的碱基配对，出现基因突变甚至DNA裂解，产生大量8-OHDG[14]。8-OHDG 是反映DNA过氧化损伤的标记物，存在于氧化损伤的肾小管上皮细胞的细胞核[15]。而自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化终产物为MDA。MDA可以引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。本研究发现，B组尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平及肾组织MDA水平均高于A组，提示NB能够促进大鼠尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平增高，并促进肾组织过氧化损伤；C、D、E组尿液Ox、Ca2+、8-OHDG水平均低于B组，D、E组肾组织MDA水平均低于B组，提示乌梅提取物能降低大鼠尿液Ox水平，进而减少尿Ca2+的排泄，并对自由基有较好的清除作用，减少过氧化损伤，从而抑制草酸钙结石的形成。

综上所述，乌梅提取物对NB所致的大鼠肾草酸钙结石具有明显的抑制作用，其机制可能与降低大鼠尿液Ox水平，进而减少尿Ca2+的排泄，减少脂质过氧化损伤有关。