羟基磷灰石对人肾小管上皮细胞骨桥蛋白表达的影响及机制探讨

余骏川，邓耀良，黎承杨，陶芝伟，关晓峰，吴基华，宁鑫，刘云龙，何子奇，刘权

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

肾结石是泌尿外科常见疾病之一，复发率高。探讨肾结石的病因与发病机制是泌尿外科研究的热点。目前认为，遗传、饮食、环境及钙代谢异常等因素相互作用参与了泌尿系结石的形成发展。其中，尿液过饱和所引起的矿物异质成核、晶体生长聚集及晶体与肾上皮细胞的黏附等引起的钙代谢异常在肾结石的发病中发挥了重要作用[1,2]。近年研究发现，肾结石中最常见的草酸钙结石起源于肾钙化斑(Randall斑)的形成[3]，羟基磷灰石(HAP)是Randall斑的核心成分[4]。骨桥蛋白(OPN)是一种非胶原性骨基质糖蛋白，参与细胞间黏附、趋化、迁移和信号传导等生理及病理过程。研究发现，OPN参与了肾结石的形成，在肾结石患者肾乳头Randall斑内及周围均发现OPN蛋白的存在[5]。目前，对Randall斑部位的结石形成过程中HAP的作用及其对OPN表达的影响尚不明确。2015年9月～2016年6月，我们观察了HAP对人肾小管上皮细胞株HK-2细胞的损伤作用及细胞内OPN的表达变化，探讨HAP在肾结石形成中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 HK-2细胞购于中国典型培养物保藏中心。HAP购于北京德科岛金科技有限公司；DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；TRIzol、逆转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒购于大连TaKaRa公司；鼠抗人OPN、β-actin内参抗体购于Abcam公司。

1.2 细胞培养 HK-2细胞在含10%FBS的DMEM/F12细胞培养液中，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，每天换液。当细胞贴壁生长到培养瓶面积的75%～80%时，用0.25%的EDTA胰酶进行消化传代。调整每个培养瓶的细胞密度为1×105/mL，用DEME/F12细胞培养液继续培养至细胞密度40%～50%时，进行后续实验。

1.3 分组及干预方法 取生长良好的第5代HK-2细胞，以3×108/L的密度接种于6孔板，待细胞融合后，分为正常对照组、HAP1组、HAP2组、HAP3组及HAP4组。正常对照组在正常培养液中培养，HAP1组、HAP2组、HAP3组及HAP4组分别加入200、400、600、800 ng/mL的HAP悬液。

1.4 细胞活力检测 采用CCK-8法。各组加入相应的HAP悬液后，每组设10个孔，在培养箱中孵育12、24、48、72 h后，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，将96孔板置于培养箱内孵育2 h。用酶标仪测定在450 nm波长处每孔的光密度OD值，计算细胞存活率，细胞存活率=(ODHAP各组/OD正常对照组)×100%，重复3次，取平均值。

1.5 细胞内OPN mRNA表达检测 采用RT- qPCR法。取各组培养24 h后细胞，按照Takara公司RNA提取试剂盒说明书进行操作，抽提各组细胞总RNA。然后继续按照Takara公司的逆转录步骤进行逆转录，所得到的cDNA进行RT-qPCR实验，以β-actin 为对照。引物由Takara公司设计合成，引物如下：OPN 上游5′-ACACATATGATGGCCGAGGTGA-3′；下游5′-GTGTGAGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3′。β-actin 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。采用2-ΔΔCt法计算各样本mRNA相对表达量。

1.6 细胞内OPN蛋白表达检测 采用Western blot法。取各组培养24 h后细胞，加入蛋白提取液裂解细胞。赛默飞公司酶标仪测定蛋白含量，每样本各取蛋白10 μg，10%SDS-PAGE电泳，PVDF膜200 mA转印2 h，以5%脱脂奶粉封闭60 min，分别加入稀释的一抗OPN(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)于4 ℃孵育12 h 后，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG 二抗室温孵育1 h，ECL化学发光法显色，曝光显影，扫描仪扫描结果。Image Lab图像分析软件分析结果，以OPN/GAPDH值作为OPN蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞活力变化结果 随着HAP浓度增加，细胞存活率逐渐降低，细胞存活率与HAP的浓度呈负相关(r=-0.566 3，P<0.01)。随着HAP作用时间延长，细胞存活率逐渐降低，细胞存活率与HAP作用时间呈负相关(r=-0.796 3，P<0.01)。见表1。

表1 各组不同时间细胞存活率比较

2.2 各组细胞内OPN mRNA表达比较 正常对照组、HAP1组、HAP2组、HAP3组、HAP4组OPN mRNA相对表达量分别为1.151±0.029、1.201±0.004、1.269±0.029、1.179±0.022、1.406±0.058，HAP2组、HAP4组OPN mRNA相对表达量均高于正常对照组(P均<0.05)。

2.3 各组细胞内OPN蛋白表达比较 正常对照组、HAP1组、HAP2组、HAP3组、HAP4组OPN蛋白相对表达量分别为0.418±0.010、0.436±0.016、0.512±0.021、0.562±0.016、0.627±0.023， HAP2、HAP3、HAP4组OPN蛋白相对表达量均高于正常对照组(P均<0.05)。见图1。

图1 各组细胞内OPN蛋白表达情况(Western blot法)

3 讨论

草酸钙晶体是肾结石的主要成分，而HAP是诱发草酸钙在肾乳头表面沉淀并凝结的重要原因[6]。Randall斑作为大多数特发性草酸钙结石在肾乳头的黏附部位，位于髓袢降支细段的基底膜，是草酸钙结石形成的起始位点，而HAP是草酸钙结石的重要组成成分[4]。Evan等[7]通过高分辨率CT发现，结石能够黏附在Randall斑上生长。但Randall斑发生HAP聚集的原因及其在肾结石发生中的作用机制尚未完全明确。

研究发现，Randall斑部位肾小管上皮细胞的损伤可导致HAP在此处的异常沉积，可能是导致肾结石发生的始动因素。研究发现，非洲绿猴肾上皮细胞表面草酸钙的黏附量与晶体聚集程度及细胞的损伤程度呈正相关[8]。当各种原因导致的肾脏氧化应激反应激活后，可导致肾小管上皮细胞炎症损伤[9]，促进肾小管上皮基底膜Randall斑部位的HAP沉淀聚集。Evan等[10]研究发现，肾结石患者的结石附着点上皮细胞受到破坏，认为肾小管上皮细胞的损伤能够为HAP聚集提供条件。细胞受损后，不仅让磷脂酰丝氨酸暴露在细胞表面[11,12]，而且还表达了如HA、OPN、CD44、膜联蛋白Ⅱ、含唾液酸的糖蛋白和核仁素相关蛋白(NRP)[13]等多种晶体黏附分子，这些分子带有负电荷，既可以通过氢键与草酸钙中的草酸根(Ox2-)作用，又可以通过静电作用和草酸钙晶体结合，从而大大增强损伤后的细胞对晶体的黏附能力。当Randall斑中的HAP大量聚集后，可导致间质的理化环境改变，进而钙化成肾乳头钙化斑，并可跟随尿液流动，流到肾盏在远端末梢小管管腔聚集。此外，当聚集的HAP达到一定数量之后，还可刺激远端小管的泌氢作用，使尿液发生酸化，使磷酸钙晶体在集合小管末端溶解，释放出钙离子及草酸根离子，形成草酸钙小晶体，导致草酸钙结石的形成。本课题组前期研究发现，肾结石患者肾组织中存在显著的钙盐结晶，并出现明显的因细胞损伤而导致的氧化应激反应[14]，提示细胞损伤是导致结石形成的重要原因。本研究发现，细胞存活率与HAP浓度呈负相关，提示随着HAP浓度增加HK-2细胞的存活率逐渐降低；细胞存活率与HAP作用时间呈负相关，提示HAP对HK-2细胞的抑制作用随着作用时间的延长逐渐增强，表明HAP对HK-2细胞具有一定的损伤作用，且与HAP的浓度及作用时间有关，可能与结石的形成有关。

OPN为带负电荷的磷酸化糖蛋白，多表达于骨组织中，也表达于肾脏、动脉血管平滑肌细胞、泌尿生殖道、胆囊等组织中。研究发现，肾结石大鼠肾脏组织中OPN表达水平明显升高，被认为是导致结石形成的关键控制因素[15,16]。Taguchi等[5]研究发现，在肾结石患者的肾小管上皮细胞和肾小管间质细胞中，Randall斑中OPN蛋白比不含Randall斑的部分表达更高。Gan等[17]也通过研究非洲绿猴肾细胞损伤发现，细胞受到损伤之后，不仅对晶体的黏附能力显著强于正常细胞，而且OPN蛋白的表达水平也有明显上升。以上研究表明，OPN作为一种重要的多功能性蛋白，与尿路结石的形成具有密切关系，在OPN介导草酸钙晶体在肾小管上皮的附着、沉积方面表现得尤为突出。Hirose等[18]研究发现，在结石形成初期，当草酸钙晶体导致肾小管上皮细胞损伤时，OPN的黏附作用可能会激发结石晶体异质成核这一过程，进而促进结石的形成。Alex等[15]也发现在结石大鼠模型中，OPN的表达呈增高趋势。本研究发现，HAP2组、HAP4组OPN mRNA表达均高于正常对照组，HAP2、HAP3和HAP4组OPN蛋白表达量均高于正常对照组，提示不同浓度的HAP干预后可使OPN mRNA及蛋白表达增加，可能与肾结石的形成有关。

综上所述，HAP对HK-2细胞具有一定的损伤作用，并可导致细胞OPN mRNA及蛋白表达增加，可能是其参与肾结石形成的机制之一。