蛋白核小球藻不同生长阶段油脂和脂肪酸组成的分析

杨慧敏,秦焰祯,杨青峰,朱宏波,胡雪琼,钟 敏,李雁群,3,*

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2.广东海洋大学海洋药物研究所,广东湛江 524088;3.广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088;4.广东海洋大学农学院,广东湛江 524088)

蛋白核小球藻不同生长阶段油脂和脂肪酸组成的分析

杨慧敏1,2,秦焰祯1,杨青峰1,2,朱宏波4,胡雪琼1,2,钟 敏1,2,李雁群1,2,3,*

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;2.广东海洋大学海洋药物研究所,广东湛江 524088;3.广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088;4.广东海洋大学农学院,广东湛江 524088)

目的:本文通过观察蛋白核小球藻油脂含量及其脂肪酸组成随培养期变化的规律,增加对小球藻油脂代谢机理的了解。方法:收集不同生长时期的蛋白核小球藻藻细胞,采用Folch法和气相色谱法对其在不同生长阶段的总脂含量和脂肪酸组成进行测定。结果:随培养期的延长,油脂含量呈现逐渐上升的趋势,其中缺氮胁迫阶段油脂总含量最高达到细胞干重的21.18%,是对数生长期的1.54倍,稳定期的1.32倍;气相色谱分析结果表明,各个阶段中不饱和脂肪酸的含量均高于饱和脂肪酸,其中缺氮胁迫阶段多不饱和脂肪酸含量最高,占总脂含量的35.90%,其中以油酸C18∶1和亚油酸C18∶2含量较高。结论:缺氮胁迫处理有利于蛋白核小球藻总脂含量的增加和多不饱和脂肪酸的积累,提高了蛋白核小球藻的油脂质量。

蛋白核小球藻,总脂含量,脂肪酸成分,生长期

微藻是一类广泛存在于不同水域(如淡水、海水、沼泽、温泉、盐碱水)等环境的光能自养型单细胞微小生物[1],部分微藻在特定的生长环境中可以积累油脂,其中以椭圆栅藻(Scenedesmusovalternus)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardii)和小球藻(Chlorellasp.)等的油脂含量较高[2]。小球藻为绿藻门小球藻属的普生性单细胞藻,常见的有蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)等[3]。小球藻的蛋白质含量接近于啤酒酵母,是优良的植物蛋白源,氨基酸种类齐全,含量接近甚至超过FAO标准[4]。据报道[5-6],蛋白核小球藻在特定的异养条件下,不饱和脂肪酸含量可高达75%(占总脂肪酸),主要集中在C16～C18,其中亚油酸含量达到47.17%,亚麻酸含量达10.03%,这在其他食品材料中较为少见。油脂中的不饱和脂肪酸,在保健功能方面有预防高血压和高血脂发生、增强免疫力、抗氧化等功效[7]。小球藻还可用于新型功能性食品、食品添加剂或食品强化剂的开发,在小球藻片和胶囊、面条、面包、饼干、提取物等方面均有应用。在利用物理及化学方法促进不同种类微藻高产油脂方面,已有许多研究成果[5-6,8-9],贺国强等[2]对蛋白核小球藻不同营养方式研究发现异养培养条件下蛋白核小球藻生长速率及油脂含量较高,其中总脂含量达到细胞干重的38.66%,分别为自养培养和混合培养条件下的2.06和1.40倍;金虹[6]等研究发现,以葡萄糖为碳源、尿素为氮源且浓度分别为30.0、1.5 mg/L时,小球藻的生物量和油脂产量分别达到8783.9 mg/L和126.3 mg(L·d);黄冠华等[10]对不同环境因素对小球藻脂肪酸组分及含量分析发现,pH5.0时,不饱和脂肪酸含量占总脂含量的79.93%,其中油酸含量占27.51%,而盐度影响实验中NaCl浓度为0.1 mol/L时,不饱和脂肪酸含量达81.18%,其中大部分为硬脂酸,占脂肪酸总含量的35.67%。花凯[11]、韩菲菲[12]、胡慧慧[13]、江怀真[14]、吴琼芳[15]等实验也表明,氮源限制、不同种类培养基及磷元素的浓度、植物生长激素等对小球藻的油脂含量及脂肪酸组成都有很大的影响。

但关于蛋白核小球藻在不同生长阶段的油脂含量及组成变化和光系统协同调配的研究却未见报道,本文就这个问题进行了初步的研究,意在为以后关于蛋白核小球藻及其油脂的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用的蛋白核小球藻(FACHB-5) 购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库;培养基 采用BG-11培养基[16],其组成为:NaNO31.5 g/L,K2HPO40.04 g/L,MgSO4·7H2O 0.075 g/L,CaCl2·2H2O 0.036 g/L,柠檬酸0.60 mg/L,柠檬酸铁铵 0.60 mg/L,Na2EDTA 0.10 mg/L,Na2CO30.02 g/L,混合微量元素1 mL,以上试剂均为分析纯,购自湛江林达试剂公司;无1.5 g/L NaNO3添加的培养基 即为缺氮培养基;异辛烷(色谱纯) 购自山东西亚化学工业有限公司;三氯甲烷、无水硫酸钠、甲醇等 均为分析纯,购自广东光华科技股份有限公司;脂肪酸标准品GLC-NESTLE-37 购自上海安谱实验科技股份有限公司。

LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;PHS-25数显pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;电子分析天平(d=0.0001) 北京赛多利斯天平有限公司;WFJ-7200可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;EYELA OSB-2000旋转蒸发仪 上海爱明仪器有限公司;DC-24氮吹仪 上海安谱实验科技股份有限公司;Trace GC Ultra气相色谱仪 Thermo Electron Corporation。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白核小球藻的培养 将蛋白核小球藻以10%的接种量接种于100 mL BG-11培养基中,置于(28±0.5) ℃环境中,24 h节能灯连续光照,光照强度为3000 lx,通入含5% CO2的洁净空气,通气量为400～600 mL/min,磁力搅拌器搅拌培养。

将处于对数生长期后期的藻细胞在无菌条件下5000 r/min离心2 min,收集藻细胞重悬于缺氮培养基中,进行缺氮胁迫培养。

1.2.2 蛋白核小球藻生长曲线的测定 采用浊度比色法测定蛋白核小球藻的生长曲线,取适量藻液稀释10倍后于分光光度计中测定在600 nm下的吸光度值A600,连续10 d每天取样测定,作出A600随培养时间的变化曲线,其中最终吸光度值取实测值与稀释倍数的乘积。

1.2.3 蛋白核小球藻油脂提取 取适量藻悬液于4 ℃、5000 r/min离心5 min,弃上清收集藻细胞,得到藻泥,用于油脂提取和脂肪酸含量测定。

取1 g的藻泥精确称重,然后置于80 ℃烘箱中烘干至恒重,再称重,计算藻泥水分含量[17]。油脂提取采用Folch法[18],称取3.0 g新鲜藻泥于4～8 ℃预冷的研钵中,加入少量石英砂和60 mL已经预冷的氯仿/甲醇溶液(2∶1,v/v)于通风橱内研磨15 min,然后将匀浆转移到离心管中,洗涤研钵3次并将洗液转移至离心管中,3500 r/min离心10 min,弃沉淀,回收上清。向上清液中加入18 mL(溶剂体积0.2倍)0.9% NaCl溶液,用振荡器剧烈振荡5 s,2000 r/min低速离心使溶液分层,弃去上层回收含有油脂的下层(氯仿层)。油脂提取液在氮吹仪下吹干,称重得粗脂肪重(g),按照公式1计算油脂含量。

式(1)

式中，m1为粗脂肪重(g),m2为藻泥重量(g),W为藻泥水分含量(%)。

1.2.4 藻油脂肪酸组成的测定 首先对提取的油脂进行甲酯化,油脂甲酯化方法如下:称取藻油约60 mg置于5 mL具塞试管中,加入4 mL异辛烷使藻油溶解充分。加入200 μL 2 mol/L KOH甲醇溶液,盖上玻璃塞,猛烈振摇30 s后静置澄清。向溶液中加入1 g无水硫酸氢钠(NaHSO4),猛烈振摇,中和氢氧化钾。继续加入试管体积约1/3～1/2的无水硫酸钠,待盐沉淀后,将含有脂肪酸甲酯的上层液吸出,4 ℃保存留作脂肪酸分析样品[19]。

采用气相色谱法测定脂肪酸的组成及含量。采用Trace GC Ultra气相色谱仪,PEG-20M毛细管色谱柱(50 m×0.20 mm×0.25 μm),氢火焰离子化检测器(FID);气化室、检测器温度均为250 ℃;柱温的升温程序为:初始温度150 ℃,保持5 min,以6 ℃/min的升温速率上升至220 ℃,保持2 min;以6.5 ℃/min升温至230 ℃并保持维持35 min。助燃气流量(空气)为50 mL/min;燃气流量(H2)为35 mL/min;尾吹气流量(N2)为30 mL/min;分流比为20∶1。

1.2.5 数据分析 所有数据均采用平均值±标准差的方式表示,采用JMP 7进行方差分析,p<0.05表示差异较显著。

2 结果与分析

2.1 蛋白核小球藻生长曲线

通过测定不同时间藻悬液的光密度A600值观察蛋白核小球藻在BG-11培养基中的生长情况,得出光密度值与培养时间的对应关系如图1所示。

图1 蛋白核小球藻生长曲线Fig.1 The growth curve of Chlorella pyrenoidosa

由生长曲线可以看出,蛋白核小球藻的生长呈S型曲线,1～2 d细胞生长处于迟缓期,此时细胞代谢系统需要适应其新的生长环境,细胞生长较慢,细胞增长较少;3～5 d由于培养基营养物质充足,细胞生长速率较大,达到对数生长期,细胞总数达到最大值;自第6 d开始由于营养消耗,生长空间限制,藻细胞生长渐入稳定期,生长速率较为缓慢,但仍有生长;自第10 d开始,细胞数量快速下降,藻细胞进入衰亡期。此结果与李炜[21]、刘香华[20]实验中普通小球藻生长周期及各生长期结果较为接近,生长周期均为8～11 d,3～5 d为对数生长期,随后进入稳定期,持续约3 d。本实验选取第3、7 d的藻细胞进行对数生长期、稳定期的油脂含量的测定。

2.2 不同生长阶段对蛋白核小球藻油脂含量的影响

蛋白核小球藻在不同生长阶段油脂含量测定结果如图2所示。由图2可知,蛋白核小球藻油脂含量在13%～22%之间。油脂含量由大到小依次为:氮缺乏胁迫期>稳定期>对数生长期,其中缺氮胁迫阶段油脂含量明显高于对数生长期和稳定期,最高达到21.18%,为对数生长期的1.54倍,稳定期的1.32倍。在营养充足条件下,对数生长期以细胞生长和细胞分裂为主,此时光合作用产生的代谢流更多的导向细胞分裂所需物质的合成,所以油脂含量不高,油脂的合成仅是为了满足细胞结构构成的需要;当进入稳定期后,藻细胞含量由于受营养限制,以细胞分裂为主的生长方式开始转化为以储存油脂维持能量供给的生长方式,所以开始积累油脂,油脂含量升高;在氮源胁迫条件下培养3 d,氮源缺乏而碳源充足的情况下,蛋白质和核酸等含氮物质合成受到抑制,光合作用不受限制,同化作用继续合成油脂,油脂含量进一步提高。这个现象符合氮缺乏胁迫条件培养,可以提高藻体的油脂含量的观点。

图2 蛋白核小球藻不同生长阶段油脂含量Fig.2 Lipid contents of Chlorella pyrenoidosa in different cultivation stages

2.3 蛋白核小球藻在不同生长期油脂脂肪酸组成分析

按照1.2.3和12.4的方法对提取的蛋白核小球藻油脂进行气相色谱分析,结果如图3所示。

根据上图对蛋白核小球藻油脂成分进行分析,结果如表1所示。

表1 蛋白核小球藻在不同生长时期的脂肪酸组成及含量(%)

注:SFA-饱和脂肪酸,UFA-不饱和脂肪酸,MUFA-单不饱和脂肪酸,PUFA-多不饱和脂肪酸。

图3 蛋白核小球藻不同生长阶段脂肪酸气相色谱图Fig.3 Gas chromatogram of Chlorella pyrenoidosafatty acid in different cultivation stages注:A:脂肪酸标准品GLC-NESTLE-37气相色谱图;B～D分别为对数生长期、稳定期及缺氮胁迫阶段油脂脂肪酸气相色谱图。

结果表明,蛋白核小球藻中各生长时期油脂脂肪酸种类基本相同,主要集中在C16～C18脂肪酸,其中以软脂酸C16∶0、C17∶1、油酸C18∶1和亚油酸C18∶2等含量较多,总含量均达到各生长阶段总脂含量的75%以上,其他短链脂肪酸相对含量较低,且各生长阶段中不饱和脂肪酸的含量均大于饱和脂肪酸,在对数生长期、稳定期、氮缺乏胁迫期,不饱和脂肪酸含量依次降低,但总含量均不低于65%。不同阶段脂肪酸组成存在一定差异,缺氮胁迫期的多不饱和脂肪酸含量最高,达到总脂含量的35.90%,其次为对数生长期和稳定期,这主要是由于亚油酸的含量变化所致,缺氮胁迫期亚油酸和α-亚麻酸相对含量达到最高,分别为25.53%和10.24%;软脂酸(C16∶0)在培养阶段呈现逐渐上升的趋势,在稳定期和缺氮胁迫期保持相对较高的含量,而棕榈油酸(C16∶1)含量总体呈现下降趋势,但变化相对较小;油酸含量在稳定期和缺氮胁迫期达到油脂总量的15%以上,亚油酸含量在三个阶段保持相对稳定且较高的水平。小球藻的营养价值与其体内不饱和脂肪酸的含量密切相关,有研究表明普通小球藻脂肪酸含量为饱和脂肪酸﹥多不饱和脂肪酸﹥单不饱和脂肪酸,且指数生长期的二十碳五烯酸含量最高达到总脂含量的17.92%[21],这与本实验结果存在一定的差距,这可能是藻株的不同导致的。

3 结论

本实验探讨了蛋白核小球藻在不同生长阶段总油脂含量及脂肪酸组成的变化。结果表明,油脂总含量由多到少依次为缺氮胁迫期>稳定期>对数生长期,缺氮胁迫期最高达到21.18%,其含量分别是稳定期和对数生长期的1.32和1.54倍;油脂脂肪酸组成方面,主要集中C16～C18脂肪酸,占脂肪酸总量的75%以上,不饱和脂肪酸的相对含量随培养的进行逐渐降低,但仍占总量的65%以上。在缺氮胁迫期油脂种类较为丰富,但其不饱和脂肪酸的相对含量有所降低，说明缺氮胁迫对小球藻脂肪酸组成有一定的影响。本文为以后小球藻油脂的高效诱导及基因工程的改造奠定了理论基础。

[1]朱顺妮,王忠铭,尚常花,等. 微藻脂肪合成与代谢调控[J]. 化学进展,2011(10):181-188.

[2]贺国强,邓志平,陶丽,等. 高油脂产率微藻的筛选及发酵条件的优化[J]. 农业生物技术学报,2010(6):22-29.

[3]Chinnasamy S,Ramakrishnan B,Bhatnagar A. Biomass Production Potential of a Wastewater Alga Chlorella vulgaris ARC1 under Elevated Levels of CO2and Temperature[J]. International Journal of Molecular Sciences,2009,10(2):518-532.

[4]梅帅,赵凤敏,曹有福,等. 三种小球藻的蛋白质营养价值评价[J]. 营养学报,2014(5):95-97.

[5]申浩洋. 普通小球藻油脂高产培养条件优化实验研究[D]. 西安:西北大学,2015.

[6]金虹,吕海棠,李文林，等.不同碳氮源对一株产油小球藻油脂积累的影响[J]. 安徽师范大学学报:自然科学版,2014(4):61-63,98.

[7]杨成源,路卫华,吴学华,等. 膏桐新品种籽油脂肪酸组成及其炼制生物柴油的潜力[J]. 植物学研究,2015,4(1):16-24.

[8]袁正求.马铃薯淀粉水解液碳源两步法促培小球藻油脂富集及机制研究[D]. 湘潭:湘潭大学,2013.

[9]石磊. 藻液pH阶段调节对普通小球藻油脂积累影响的实验研究[D].天津：天津大学,2013.

[10]黄冠华,陈峰. 环境因子对异养小球藻脂肪酸组分含量和脂肪总酸产量的影响[J].可再生能源,2009(3):69-73.

[11]花凯. 激素类物质对小球藻培养的影响研究[D].北京：北京化工大学,2015.

[12]韩菲菲. 以高油脂产率为目标的小球藻光自养培养工艺优化与初步放大[D]. 上海:华东理工大学,2013.

[13]胡慧慧,徐年军. 不同培养基及组成对2种小球藻生长和油脂的影响[J].生物学杂志,2012(4):12-16.

[14]江怀真. 培养条件对海水小球藻生长及油脂积累的影响[D]. 青岛:中国海洋大学,2010.

[15]吴琼芳,张莹,罗舒怀,等. 氮限制对普通小球藻积累油脂过程中生化组成与光合生理的影响[J]. 植物科学学报,2016(2):280-288.

[16]Chih-chun yang,Rex Wen,Claire Shen,et al. Using a Microfluidic Gradient Generator to Characterize BG-11 Medium for the Growth ofCyanobacteriaSynechococcuselongatus PCC7942[J]. Molecular Diversity Preservation International(MDPI),2015,6(11):1755-1767.

[17]Xian-ming shi,Feng Chen,Jian-Ping Yuan,et al. Heterotrophic production of lutein by selected Chlorella strains[J]. Kluwer Academic Publishers,1997,9(5):445-450.

[18]Folch Lee S,M Sloane,Stanley G H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.[J]. The Journal of Biological Chemistry,1957,226(1):497-509.

[19]刘宪夫,孙利芹,王长海. 小球藻油脂不同提取方法的比较[J]. 食品研究与开发,2014(3):28-32.

[20]刘香华,刘雷,曾慧卿. 不同碳源及光照对小球藻生长和产油脂的影响[J]. 安全与环境学报,2012(3):6-10.

[21]陈炜,梁明明,白永安,等. 小球藻不同生长时期总脂含量和脂肪酸组成的变化[J]. 水产科学,2013,32(9):545-548.

Analysis of lipid content and fatty acid composition ofChlorellapyrenoidosainin different cultivation stages

YANG Hui-min1,2,QIN Yan-zhen1,YANG Qing-feng1,2,ZHU Hong-bo4,HU Xue-qiong1,2,ZHONG Min1,2,LI Yan-qun1,2,3,*

(1.College of Food Science and Technology,Zhanjiang 524088,China;2.Research Institute for Marine Drugs and Nutrition,Zhanjiang 524088,China;3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China;4.College of Agriculture,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Objective:In order to increase more deeply understanding the lipid synthesis ofC.pyrenoidosa,the changes of the lipid content and the fatty acid composition with the cultivation stage were observed. Methods:The algal biomass was collected at each cultivation stage by centrifugation of cultivation broth,the lipid was extracted and the fatty acid compositions were analysed. Results:The results showed that the total content of lipid was 21.18% in the nitrogen deficiency stage,which was 1.54 and 1.32 fold of that at logarithmic growth phase and stationary phase,respectively. The GC results indicated that long chain fatty acids of C16～C18 were the dominant fatty acids ofC.pyrenoidosa,and most of them were oleic acid(C18∶1)and linoleic acid(C18∶2),accounting for more than 35.90% of the total fatty acids. Conclusion:Increasing total lipid content and polyunsaturated fatty acid accumulated in nitrogen deficiency stress stage,improving the lipid quality ofC.pyrenoidosa.

Chlorellapyrenoidosa;lipid content;fatty acid composition;cultivation stages

2016-09-26

杨慧敏(1991-)，女，在读硕士研究生，研究方向：微藻活性物质研究与开发，E-mail：yanghuimin0405@163.com。

*通讯作者:李雁群(1963-)，男，博士，教授，研究方向：发酵工程，E-mail：liyq2004@126.com。

广东省自然科学基金项目(2015A030313616)；湛江市科技计划项目(2015A03026)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.027