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两个品系羊栖菜褐藻胶与褐藻糖胶的联合提取及理化性质测定

2017-04-14李雅静范家兴程柳坤许加超付晓婷

食品工业科技 2017年6期
关键词:褐藻品系凝胶

李雅静,范家兴,程柳坤,许加超,高 昕,付晓婷

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266000)

两个品系羊栖菜褐藻胶与褐藻糖胶的联合提取及理化性质测定

李雅静,范家兴,程柳坤,许加超,高 昕,付晓婷*

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266000)

本文利用联合提取方法对浙江洞头两个品系羊栖菜(SF-1、SF-2)的褐藻胶与褐藻糖胶进行了提取,并对其理化性质进行了测定。结果表明,品系SF-1的褐藻胶含量略高于SF-2,差异不显著(p=0.149),而后者的褐藻糖胶含量显著高于前者(p<0.01)。两个品系羊栖菜褐藻胶理化性质相似,具有粘度低、凝胶强度高、剪切稀化,触变环面积小以及低温下不形成凝胶等特点。而1H-NMR分析表明两种褐藻胶以均聚结构为主,尤其是均聚甘露糖醛酸嵌段,SF-1相较SF-2甘露糖醛酸比例更高。两个品系羊栖菜的褐藻糖胶化学组成测定结果表明两种褐藻糖胶的结构组成差异较大。一方面,SF-1的硫酸根含量接近于SF-2的两倍,另一方面,SF-1中以岩藻糖所占比例最高(42.24%),而SF-2中甘露糖比例最高(36.40%),其次为岩藻糖(31.97%)。总的来说,两个品系羊栖菜具有高含量的褐藻胶与褐藻糖胶,是联合提取的优质原料,而两品系褐藻糖胶结构上的差异也会使其有不同的性能与应用。

羊栖菜,褐藻胶,褐藻糖胶,联合提取,理化性质

羊栖菜是我国经济海藻之一,广泛分布于辽东半岛、雷州半岛以及浙江省和福建省沿海地区。其中浙江省洞头县是我国最主要的生产基地,被称为“中国羊栖菜之乡”。羊栖菜因具有很高的食用价值和药用价值,被誉为“长寿菜”。研究表明,羊栖菜中的活性多糖具有抗氧化、抗菌、降血脂、抗肿瘤、增强免疫力和神经保护等活性[1-3]。除了气囊细长的传统羊栖菜品系(SF-1),浙江省洞头县近年新培育出一种气囊相对较大的新品系“浙海一号”(SF-2),较大的气囊使其具有较高的复水率。两个品系均由中国海洋大学大型海藻种质库(Culture Collection of Seaweed at the Ocean University of China,http://www3.ouc.edu.cn/mogbl/)提供。

褐藻糖胶的传统提取方法有水提法,酸提法,表面活性剂加超声辅助提取以及酶辅助提取等。而在提取过程中,褐藻酸盐沉淀物总是被丢弃,并且大多数藻酸盐仍然以不溶性藻酸盐的形式存在的藻类残渣中。而传统的褐藻胶提取方法主要是碱消解法,其中用于藻体软化固色的甲醛等有机试剂具有较大的争议,并且保留在提取液或藻渣中的褐藻糖胶也总是被浪费。因此选择一种优越的联合提取的方式显得尤为必要。

本文改进了传统褐藻胶与褐藻糖胶提取方法,利用酶辅助联合提取方法对两个品系羊栖菜的褐藻胶、褐藻糖胶进行提取,将提取过程中产生的藻渣和含有褐藻胶的沉淀物收集起来,作为褐藻胶的提取原料,同时避免了褐藻胶提取前藻体软化所使用的有机试剂,节省了原料,降低了生产成本,节约了时间,是经济环保适用于工业生产的联合提取方式。本文进一步从羊栖菜多糖资源开发与利用的角度,比较两个品系多糖的含量及其理化性质差异,为多糖的深加工利用提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

两个品系羊栖菜(SF-1,SF-2) 2014.6收获自浙江省洞头县;纤维素复合酶 诺维信生物技术有限公司;重水 ARMAR Chemicals;葡聚糖系列分子量国家标准品 中国计量科学研究院;D-果糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、肌醇 均为生化试剂;L-岩藻糖 索莱宝生物技术有限公司;明胶、碳酸钠、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇、甲醇、苯酚、吡啶、乙酸酐、盐酸、硫酸、氯化钡 均为分析纯。

Agilent 6890 N气相色谱 美国Agilent公司;Agilent 1100高效液相色谱仪,四元梯度泵,UVA检测器 美国Agilent公司;MCR101流变仪 奥地利安东帕有限公司;722旋转粘度计 上海欣巧仪器有限公司;HC-3018质构仪 安徽中科中佳科学仪器有限公司;UV2102可见紫外分光光度计 上海尤尼柯公司;Pro Pulse 500 MHz核磁共振波谱仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 褐藻胶与褐藻糖胶的共同提取 准确称取4 g藻粉,加入100 mL含1%纤维素复合酶的磷酸缓冲液,在50 ℃条件下振荡提取12 h,改变温度至70 ℃,继续振荡提取3 h,离心,4 ℃保存藻渣。上清液中加入50 mL 2% CaCl2(w/v)溶液,4 ℃静置过夜后离心,收集沉淀-20 ℃保存,上清液中加入无水乙醇至总体积的20%,继续离心,得沉淀-20 ℃保存,上清液中继续加入无水乙醇至60%,4 ℃保存8 h后离心,得褐藻糖胶,45 ℃烘干过夜,称重计算得率。合并藻渣与两次沉淀,以1∶25料液比加入1%碳酸钠溶液,60 ℃条件下振荡提取3 h,后褐藻胶的提取采用酸沉法[4]。

1.2.2 两个品系羊栖菜褐藻胶性质研究

1.2.2.1 羊栖菜褐藻胶分子量测定 采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC),使用Tsk-gel GM PWXL色谱柱测定多糖分子量;流动相为0.2 mol/L NaCl水溶液,柱温35 ℃,流速0.5 mL/min,示差检测器。将各葡聚糖系列分子量标准品(1.5×106,5.21×105,2.89×105,1.1×105,6.06×104,1.26×104以及4.32×103g/mol)及多糖样品用流动相配成0.1%(w/v)水溶液,以标准葡聚糖分子量的对数(log MW)对色谱保留时间(tR)作图,得标准曲线log MW=13.163-0.5172tR(R2=0.9918),计算样品相对分子量。

1.2.2.2 羊栖菜褐藻胶粘度与凝胶强度测定 粘度测定:配制1%褐藻胶溶液,使用旋转粘度计测定,重复三次[5]。凝胶强度测定:配制浓度为1%(w/v)的褐藻酸钠溶液,取适量倒入透析袋中(截留分子量3500),浸入10% CaCl2溶液透析过夜,弃去透析袋,取5 cm(直径)×2.5 cm圆柱状凝胶使用质构仪测定[6]。测量选择直径为9 mm的圆柱形探头为测试探头,触发力5 g,测试速率为0.8 mm/s,压缩距离20 mm,记录凝胶破裂时的最大力,单位为g,并根据探头截面积换算为g/cm2。

1.2.2.3 羊栖菜褐藻胶的核磁共振氢谱测定[6]准确称取待测褐藻酸钠样品200 mg,先用超纯水完全溶解,再用1 mol/L HCl溶液调节pH至3.0,100 ℃水浴1 h,冷却,用1 mol/L NaOH溶液调pH至中性,使用截留分子量1000的透析袋在超纯水中透析完全,溶液冻干,用重水复溶,反复冻溶三次,进行核磁分析。

1.2.2.4 羊栖菜褐藻胶流变学性质测定[7]所有流变学性质测定均选择直径为50 mm不锈钢的平行板测量系统。

a.浓度对羊栖菜褐藻胶粘度和剪切应力影响的测定:配制质量分数为0.2%、0.5%、1%和2%的羊栖菜褐藻酸钠溶液,测试温度为20 ℃,在剪切速率0.1 s-1至600 s-1范围内,记录流动曲线,并将剪切应力流动曲线与Power law模型τ=kγn进行数学拟合,其中τ为剪切应力,k为粘度系数,γ为剪切速率,n为流动指数。

b.温度对羊栖菜褐藻胶粘度影响的测定:配制质量分数为1%的褐藻酸钠溶液,固定剪切速率为100 s-1,将温度从10 ℃升至90 ℃,记录流动曲线。

c.羊栖菜褐藻胶溶液触变性的测定:配制质量分数为1%的褐藻酸钠溶液,温度设定在20 ℃,采用两步程序Steady State Flow使剪切速率先从0.1 s-1增加到600 s-1,之后立即以同样的变化速率从600 s-1下降到0.1 s-1,记录整个过程的剪切应力的变化情况。

d.羊栖菜褐藻胶溶液动态粘弹性的测定:配制质量分数为1%的褐藻酸钠溶液,测试温度20 ℃,频率范围为0.1到20 Hz。在线性粘弹区,设定振荡应变为2%,随振荡频率变化,测定样品的贮藏模量G′,损耗模量G″和tanδ的变化。

1.2.3 两个品系羊栖菜褐藻糖胶化学组成测定 总糖含量测定采用硫酸苯酚法[8],硫酸根含量测定采用明胶-BaCl2比浊法[9]。单糖组成测定采用柱前衍生气相色谱法[5]。

1.2.4 数据处理与统计分析 数据表示为平均值±标准差(SD)。使用独立样本T检验(SPSS V19.0)对两个品系的褐藻胶褐藻糖胶含量进行统计分析,在p<0.05时认为组间显著不同。多糖含量与流变学特性曲线作图均采用OriginPro 9。1H-NMR图谱分析使用软件MestReNova 6.1.1。

2 结果与分析

2.1 两个品系羊栖菜褐藻胶与褐藻糖胶含量

两个品系羊栖菜SF-1,SF-2的褐藻胶与褐藻糖胶含量见图1,并列举了前人对海带(Laminariajaponica)和泡叶藻(Ascophyllumnodosum)的研究数据作为对比[10-12]。由图1可知,SF-1的褐藻胶含量略高于SF-2(p=0.149),以及泡叶藻和海带。SF-2褐藻胶含量与泡叶藻相当,略高于海带。泡叶藻主要分布于欧洲西北海岸以及北美洲东北部分海岸,从上世纪五十年代开始作为邻近国家的褐藻胶生产原料[13]。而海带广泛分布于中国,韩国和日本海域,是我国生产褐藻胶的主要原料。实验结果表明,两个品系羊栖菜褐藻胶含量均高于海带,且不低于泡叶藻,具有作为褐藻胶提取原料的潜在价值。就褐藻糖胶含量而言,两个品系羊栖菜远远高于其他两种褐藻,且品系SF-2含量显著高于SF-1(p<0.01)。从两种多糖的总含量来看,两个品系羊栖菜均高于海带和泡叶藻,特别是品系SF-2,在褐藻多糖开发具有很大优势。

图1 两个品系羊栖菜、海带以及泡叶藻多糖含量比较Fig.1 Comparison of the polysaccharides contents of two Sargassum fusiforme strains with Laminaria japonica and Ascophyllum nodosum

2.2 两个品系羊栖菜褐藻胶性质分析

2.2.1 褐藻胶分子量、粘度与凝胶强度的分析 两个品系羊栖菜褐藻胶的分子量、粘度以及凝胶强度结果见表1。结果显示,两个品系羊栖菜的分子量、粘度以及凝胶强度都很接近。多项研究表明分子量与粘度呈正相关[14-15],本次实验SF-1相对SF-2分子量较低,但粘度却较高,这可能与不同品系褐藻胶本身的结构有关。羊栖菜褐藻酸钠凝胶强度很高,这可能与其两种糖醛酸的比例以及排列有较大的关系。

表1 两个品系羊栖菜褐藻胶的理化性质

粘度通常是影响褐藻胶应用的关键指标,不同粘度褐藻胶往往有不同的用途。根据1999年Hernández-Carmona的报道,褐藻胶大致可分为三类:粘度大于800 mPa·s为高粘度褐藻胶,粘度介于400与800 mPa·s之间为中等粘度褐藻胶,粘度在400 mPa·s以下为低粘度褐藻胶[16]。羊栖菜褐藻胶属于低粘度褐藻胶,多用于造纸,果汁以及纺织印染[16]。根据Zubia的统计表明马尾藻类褐藻胶大多属于低粘度褐藻胶[17]。

2.2.2 褐藻胶核磁共振氢谱(1H-NMR)分析 褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid)和α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid)组成的线性多糖,因此两种糖醛酸的含量、比例以及排列影响了褐藻胶的各方面性能。褐藻胶线性分子中存在均聚M、均聚G以及杂聚MG三种嵌段结构,而利用1H-NMR图谱即可解析褐藻胶中糖醛酸的组成和序列结构。糖醛酸结构序列及其在1H谱中的信号归纳于表2。

表2 海藻酸钠片段质子峰位移

两个品系羊栖菜褐藻胶的核磁图谱见图2。从图2中可以看出,两个品系褐藻胶M、G构成相似。这也可以解释其褐藻胶分子量、粘度、凝胶强度相似的现象。

Grasdalen等利用1H-NMR和13C-NMR对竭藻酸钠的结构序列进行了研究,首次得到了清晰的1H核磁图谱,并确定了M、G片段的质子峰位移,提出了计算公式[18-20],公式(1)到(6)见下,I表示峰强。本文参照他们的方法,计算单糖和二糖的摩尔比,结果见表3。羊栖菜两个品系的FM含量均高于FG含量,且M/G值相似,SF-1略高于SF-2。另外,嵌段分布参数η用于衡量各嵌段的分布情况,其计算公式为η=FMG/(FM×FG)或 η=FGM/(FM×FG)。两个品系的嵌段分布参数η值均小于1,尤其是SF-1褐藻胶,表明羊栖菜褐藻胶以均聚嵌段为主,MG杂聚嵌段含量(FMG+FGM)比例很低,分别仅占到0.14和0.192。研究表明,以多聚甘露糖醛酸为主褐藻胶具有良好抗肿瘤活性,而以多聚古罗糖醛酸为主的褐藻胶往往具有很强的生物吸附能力[6]。已有报道表明羊栖菜多糖具有良好的抗肿瘤活性[1]。另一方面,M比例较高会使褐藻胶更有弹性,而G比例较高可以使褐藻胶更坚固[6]。

表3 两个品系羊栖菜褐藻胶的结构序列数据

图2 两个品系羊栖菜褐藻酸钠1H NMR图谱Fig.2 1H NMR spectra for solution of alginates from SF-1(A)and SF-2(B)

FG=IG-1/(IGM-5+IG-5)

式(1)

FGG=IGM-5/(IGM-5+IG-5)

式(2)

M/G=(1-FG)/FG

式(3)

FM+FG=1

式(4)

FM=FMM+FMG

式(5)

FG=FGG+FGM

式(6)

2.2.3 褐藻胶流变学性质的分析

2.2.3.1 浓度对羊栖菜褐藻胶粘度和剪切应力影响分析 浓度对两个品系羊栖菜粘度和剪切应力的影响见图3和图4。从图中可以看出两个品系羊栖菜褐藻胶的粘度和剪切应力随着浓度的降低而降低,这是因为褐藻胶浓度的增加使得溶液中单位体积内分子数增加,分子间的摩擦增加,从而溶液流动阻力增加。而当浓度不变时,溶液的粘度随着剪切速率的增加而降低,表现为剪切变稀的假塑性流体。

图3 浓度对两个品系羊栖菜褐藻胶溶液粘度的影响Fig.3 Effect of concentration on viscosity of alginates from two Sargassum fusiforme strains

图4 浓度对两个品系羊栖菜褐藻胶溶液剪切应力的影响Fig.4 Effect of concentration on shear stress of alginates from two Sargassum fusiforme strains

将褐藻胶剪切应力流动曲线与Power law模型进行拟合,结果列于表4。其中粘度系数k越大,表示液体越粘稠。流动指数n与液体的流动性有关,n<1为剪切变稀的假塑性流体,n与1的差值越大表明液体假塑性程度越大;n=1为牛顿流体,n越接近于1表明液体越接近牛顿流体;n>1则表明液体为剪切变稠的胀塑流性流体[20]。结果表明随着褐藻胶溶液浓度的降低,k值减小,溶液粘度降低。品系SF-1褐藻胶溶液的n值随着浓度的降低,流动指数反而降低,表明2%的褐藻胶溶液最接近牛顿流体,而0.2%的褐藻胶溶液假塑性程度最大。而品系SF-2褐藻胶溶液的n值随着溶液浓度的降低先增大后降低,0.5%的褐藻胶溶液n值高达0.989,最接近牛顿流体,而2%褐藻胶溶液假塑性程度最大。

表4 不同浓度褐藻胶的粘度系数和流动指数

2.2.3.2 温度对羊栖菜褐藻胶粘度影响分析 图5是两个品系羊栖菜1%褐藻胶溶液粘度随温度的变化曲线。结果表明,两个品系羊栖菜褐藻胶溶液粘度随着温度的升高而降低。这是因为随着温度的升高,溶液体系中分子活动越剧烈,减小了分子间相互作用力,从而降低了溶液的流动阻力,表现为粘度降低。在低温下,褐藻胶溶液也不能凝胶,这保证了其在冷冻食品中的应用。

图5 温度对两个品系羊栖菜褐藻胶溶液粘度的影响Fig.5 Effect of temperature on viscosity of alginates from two Sargassum fusiforme strains

2.2.3.3 羊栖菜褐藻胶溶液触变性分析 两个品系羊栖菜褐藻胶溶液的触变性曲线见图6。由图6可知,两个品系褐藻胶触变曲线相似,触变环面积都很小,表明经外力作用,体系发生较大变化后可快速恢复,有助于食品加工过程中食品的保型。结果表明两个品系褐藻胶可以作为优良的食品添加剂。

图6 两个品系羊栖菜褐藻胶的触变性曲线Fig.6 The thixotropic curves of alginates from two Sargassum fusiforme strains

2.2.3.4 羊栖菜褐藻胶溶液动态粘弹性分析 图7和图8分别为两个品系羊栖菜褐藻胶溶液动态粘弹性图,其中G′(储能模量)代表弹性部分,G″(损耗模量)代表粘性部分,tanδ=G″/G′表征体系的粘弹性的程度。G′,G″曲线的交汇点处tanδ=1,而当tanδ>1时,样品体系以粘性为主的,tanδ<1时,体系以弹性为主。由图可知两个品系羊栖菜褐藻胶溶液的动态粘弹性曲线非常相似,褐藻胶溶液的G′,G″都随着频率的增加而增加,当频率低于15 Hz时,G′小于G″,tanδ>1,体系以粘性为主,但随着频率的增加G′逐渐超过G″,当频率高于15 Hz时,G′大于G″,tanδ<1,此时体系以弹性为主。羊栖菜褐藻胶溶液的G′与G″交汇点在15 Hz,相对比于萱藻的10 Hz[7]和多肋藻的5 Hz[5],表明体系以粘性为主。

图7 品系SF-1褐藻胶的动态粘弹性Fig. 7 Dynamic viscoelastic of alginate from SF-1

图8 品系SF-2褐藻胶的动态粘弹性Fig.8 Dynamic viscoelastic of alginate from SF-2

2.3 两个品系羊栖菜褐藻糖胶化学组成分析

两个品系羊栖菜褐藻糖胶的总糖含量,硫酸根含量以及单糖组成列于表5,单糖组成气相分析图见图9。结果表明品系SF-1褐藻糖胶的总糖含量和硫酸根含量均高于品系SF-2,尤其是硫酸根含量,前者接近后者的两倍。在单糖组成方面,品系SF-1中,岩藻糖比例最高,其次依次为甘露糖,葡萄糖,木糖以及半乳糖。而在品系SF-2中甘露糖所占比例最高,其次才是岩藻糖,接下来依次为木糖,葡萄糖和半乳糖。两个品系羊栖菜褐藻糖胶在单糖组成,硫酸基含量等方面的差异可能使得他们的性能与活性有很大不同,从而影响他们的应用。

表5 两个品系羊栖菜褐藻糖胶的化学组成(%)

图9 羊栖菜褐藻胶的单糖组成气相分析Fig.9 Chromatogram for monosaccharides components of alginates from two Sargassum fusiforme strains注:A:单糖标准品气相色谱图,B:品系SF-1褐藻糖胶气相色谱,C:品系SF-2褐藻糖胶气相色谱图;1.鼠李糖;2.岩藻糖;3.阿拉伯糖;4.木糖;5.甘露糖;6.葡萄糖;7.半乳糖;8.肌醇。

注:a,指占褐藻糖胶质量的百分比;b,指占褐藻糖胶总糖的百分比。

3 结论

本文建立了一种褐藻胶、褐藻糖胶酶法联合提取工艺,相较传统提取工艺而言,是一种更加经济环保适用于工业生产的有效提取工艺。本文利用此工艺对洞头县两个品系羊栖菜的褐藻胶及褐藻糖胶进行了提取和理化性质测定。就褐藻胶而言,两个品系羊栖菜褐藻胶含量较高,与传统褐藻胶提取原材料海带和泡叶藻褐藻胶含量相当。理化性质测定表明两个品系羊栖菜褐藻胶的分子量、MG组成、黏度、凝胶强度以及流变学特性相似,是优良的食品添加剂。就褐藻糖胶而言,且两个品系羊栖菜褐藻糖胶含量均高于海带及泡叶藻,尤以SF-2品系最高。两种褐藻糖胶在总糖含量、单糖组成以及硫酸根含量方面具有较大差异,其结构与活性的关系还需进一步探索。

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Co-extraction and characterization of alginate and fucoidan from twoSargassumfusiformestrains

LI Ya-jing,FAN Jia-xing,CHENG Liu-kun,XU Jia-chao,GAO Xin,FU Xiao-ting*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266000,China)

Our present study put emphasis on the alginate and fucoidan extracted from two strains(SF-1 and SF-2)ofSargassumfusiformefrom Dongtou,Zhejiang province,by co-extraction technology. The results showed that the content of alginate of SF-1 was relatively higher than that of SF-2(p=0.149),while the fucoidan content of SF-2 was significantly higher than that of SF-1(p<0.01). Moreover,the alginates from two strains were similar with each other on some physical and chemical properties,and both of them had properties like low viscosity,high gel strength,shear thinning,small thixotropic area,and none gel-formation at low temperature. The results of1H-NMR indicated that two kinds of alginates were mainly composed by homopolymeric blocks,especially polymannuronic blocks,and the alginate in SF-1 contain more mannuronic acid than that in SF-2. The chemical compositions of fucoidans from twoS.fusiformestrains were detected,and the results showed that there were significant differences between their structures. On one hand,the sulfate content of SF-1 fucoidan was almost two times that of SF-2 fucoidan. On the other hand,the most abundant monosaccharide in fucoidan from SF-1 was fucose(42.24%),while which in SF-2 fucoidan was mannose(36.40%),followed by fucose(31.97%). In conclusion,the high content of alginate and fucoidan indicated that the twoS.fusiformestrains could be developed as useful raw materials for the co-production of alginate and fucoidan,and the fucoidans from two strains with different compositions might have different properties and applications

Sargassumfusiforme;alginate;fucoidan;co-extraction;characterization

2016-09-01

李雅静(1990-),女,硕士研究生,研究方向:食品化学与营养支持,E-mail:sakura_yj@163.com。

*通讯作者:付晓婷(1980-),女,副教授,研究方向:海藻资源生物加工与利用、海藻保健食品及功能性化妆品开发,E-mail:xiaotingfu@ouc.edu.cn。

国家海洋局海洋公益项目(201405040);科技部中韩国际合作项目(2015DFG32290)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)06-0090-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.008

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纤维素气凝胶的制备与应用研究进展
超轻航天材料——气凝胶
4个地被菊新品系对湿热胁迫的耐受性研究
保暖神器——气凝胶外套
山东地区茶用元宝枫品系的比较与筛选
“冻结的烟”——气凝胶
褐藻酸裂解酶的研究进展
褐藻胶提取及制备可食性膜工艺研究
陆川油茶优良砧木品系的初步筛选