黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导结肠炎大鼠的改善作用研究

钱 江,梁金强,邱玉文,王园园,付新录,宋 莹,林 约,黄芝瑛,*

(1.中山大学实验动物中心,广东广州 510006;2.无限极(中国)有限公司,广东江门 510065)

黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导结肠炎大鼠的改善作用研究

钱 江1,梁金强1,邱玉文1,王园园2,付新录1,宋 莹1,林 约1,黄芝瑛1,*

(1.中山大学实验动物中心,广东广州 510006;2.无限极(中国)有限公司,广东江门 510065)

目的:探讨黄芪和麦冬复合多糖对TNBS(三硝基苯磺酸)诱导的大鼠溃疡性结肠炎的改善作用及其可能机制。方法:将40只SPF级SD大鼠按体重随机分为四组,分别为空白对照组、TNBS模型组、柳氮磺吡啶对照组、黄芪和麦冬复合多糖组。空白对照组不造模,其余三组用TNBS溶液灌肠制作溃疡性结肠炎模型后,空白对照组给予0.9%氯化钠溶液,柳氮磺吡啶对照组给予柳氮磺吡啶混悬液(150 mg/kg),黄芩和麦冬复方多糖组给予复合多糖(300 mg/kg),连续给药14 d。给药后评估大鼠体重增长情况、大鼠疾病活动指数(DAI);计算脾脏指数和胸腺指数,观察结肠大体和组织学损伤情况;测定血清细胞因子TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10含量。结果:与空白对照组比较,TNBS模型组动物体重、胸腺重量均明显减少(p<0.05),DAI、脾脏重量、结肠大体和组织学损伤评分均显著升高(p<0.05),血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明显升高(p<0.05),IL-10水平明显下降(p<0.05)。与TNBS模型组比较,柳氮磺吡啶对照组、黄芩和麦冬复合多糖治疗组体重、胸腺重量均明显增加,DAI、脾脏重量、结肠大体和组织学损伤评分均显著降低,血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明显下降(p<0.05),IL-10水平明显升高(p<0.05)。结论:黄芪与麦冬复合多糖对TNBS诱导的大鼠结肠炎具有一定的改善作用,这可能与抑制促炎性因子(TNF-α、IL-2、IL-6)和刺激抗炎性因子(IL-10)的释放有关。

黄芪和麦冬复合多糖,结肠炎,TNBS

溃疡性结肠炎(UC)是一种常见的慢性肠道疾病,其病因不明、反复发作、病程迁延难愈[1]。主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等,国内外流行病学数据显示,溃疡性结肠炎发病率呈现明显的增高趋势,被世界卫生组织列为现代难治病之一[2]。临床治疗溃疡性结肠炎多以氨基水杨酸类药物、肾上腺糖皮质激素、免疫抑制剂等为主,但因其副作用较多,患者依从性较差,限制了此类治疗方法的长期使用[3]。黄芪和麦冬作为我国传统中药之一,自古以来药食兼用,其治疗和保健作用已被我国两千多年的临床经验所证实[4]。作为黄芪和麦冬的主要有效成分之一,黄芪多糖和麦冬多糖增加机体免疫功能、抗炎、抗病毒、抗衰老等诸多作用已得到证实[5],而其对溃疡性结肠炎是否具有治疗作用尚未见文献报道。三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎症状和组织学改变与人类UC类似,是评估药物对UC的治疗作用的经典模型。因此本实验将黄芪多糖和麦冬多糖按一定比例组合制成复方多糖,用于三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠溃疡性结肠炎的治疗,探讨其治疗作用及其可能机制。

表1 大鼠疾病活动指数(DAI)

注:“-”表示粪便性状和粪便隐血无1分和3分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄芪和麦冬复合多糖 无限极(中国)有限公司,由黄芪多糖和麦冬多糖混匀而成,多糖含量:96.5%,批号:20150731;柳氮磺吡啶肠溶片 上海福达制药有限公司,批号:20141013;SPF级SD大鼠 6～8周龄,雌雄各半,体重220～250 g,中山大学实验动物中心提供,动物许可号SCXK(粤)2011-0029;SPF级小鼠大鼠维持配合饲料 广东省医学实验动物中心,生产许可证:SCXK(粤)2013-0002;大鼠饲养环境 中山大学实验动物中心[SYXK(粤)2011-0112];5% TNBS溶液、戊巴比妥钠 Sigma;便隐血(OB)试剂盒 珠海倍索生物技术有限公司;Rat TNF CBA Flex Set、RAT IL-2、6、10 CBA Flex Set 美国BD公司;一次性使用肛门导管 扬州市桂龙医疗器械有限公司。

TP1020脱水机、EG1160石蜡包埋机、RM2155切片机、DM5000B生物荧光显微镜 德国Leica公司;Multiskan Ascent多功能酶标仪 美国Thermo公司;FACSCalibur流式细胞仪 美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与干预 动物适应性喂养1周后,40只SD大鼠按体重随机分为四组:阴性对照组、TNBS模型组、柳氮磺吡啶阳性对照组、黄芪和麦冬复合多糖治疗组。分组后,动物禁食不禁水24 h,除空白对照组外,其他组动物用3%戊巴比妥钠尾静脉注射麻醉(30 mg/kg)。动物麻醉后,用一次性肛门插管轻柔插入结肠约8 cm后注入TNBS造模药液(30 mg/kg),大鼠提尾倒置60 s让药液充分停留结肠内[6]。造模后,空白对照组灌胃给予0.9%氯化钠溶液,柳氮磺吡啶对照组灌胃给予柳氮磺吡啶混悬液,剂量为150 mg/kg,黄芩和麦冬复合多糖组灌胃给予300 mg/kg复合多糖,动物自由饮水和进食,连续给药14 d。

1.2.2 动物观察指标 每日观察大鼠的粪便性状(粪便粘稠度、肛周污秽情况、粪便隐血)、进食情况和精神行为状态。动物每周称重两次,按表1进行评分后计算疾病活动指数(DAI)[7-8],DAI=(体重下降分数+粪便性状分数+粪便隐血分数)/3。

1.2.3 标本取材 收集造模前1 d、造模后第3 d、动物解剖前粪样测定隐血。大鼠给药结束后,禁食不禁水12 h,用3%戊巴比妥钠尾静脉注射麻醉(30 mg/kg),动物麻醉后腹主动脉采血5 mL,室温静置10 min后以3000 r/min离心,吸出血清后分装,放置-80 ℃冰箱保存。采血结束后取胸腺及脾脏,称重;取出距肛门1～8 cm处结肠段,肉眼观察评分后沿肠系膜缘剪开肠腔,将结肠组织固定于10%福尔马林,常规石蜡制片,H-E染色,然后进行组织病理学检查。评分标准如下:结肠轻度充血水肿记1分;结肠明显水肿,肠粘膜粗糙呈颗粒状记2分;结肠粘膜溃疡形成,溃疡最长径1 cm记3分;结肠粘膜溃疡形成,溃疡最长径介于1～2 cm之间记4分;结肠粘膜溃疡形成,溃疡最长径2 cm记5分;结肠全段的肠壁坏死或动物死亡记6分。

1.2.4 血清中细胞因子水平检测 用流式液相多重组蛋白定量技术测定血清中TNF-α、IL-2、IL-10等含量,通过血清与捕获微球共孵育,FITC标记后洗涤,流式细胞仪检测后用CBA分析软件批量数据分析;用ELISA法测定IL-6。具体步骤按照说明书进行。

1.3 统计学分析

表2 黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导的大鼠结肠炎的治疗作用(n=10)

注:*表示与空白对照组比较,p<0.05;#表示与TNBS模型组比较,p<0.05;表3、表4同。

表3 黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导的结肠炎大鼠胸腺和脾脏的影响(n=10)

2 结果与分析

表4 黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导的结肠炎大鼠血清中各细胞因子含量的影响(n=10,pg/mL)

评分)均较TNBS模型对照组显著改善,表明黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导的大鼠结肠炎具有明显治疗作用。

动物胸腺、脾脏脏器重量及脏器系数结果表明,黄芪和麦冬复合多糖组动物脾脏脏器重量及脏器系数小于TNBS模型组,胸腺脏器重量及脏器系数大于TNBS模型组。脾脏和胸腺是哺乳动物重要的免疫器官,是T淋巴细胞与B淋巴细胞聚集的场所。这表明黄芪和麦冬复合多糖可通过保护TNBS造模大鼠的免疫器官,提高动物免疫力进而达到改善大鼠溃疡性结肠炎的作用。

免疫调节的异常在溃疡性结肠炎的发病过程中起核心作用。CD4+/CD8+比例升高,导致免疫调节异常(包括T细胞、细胞因子及其他细胞受体异常),进一步导致炎症细胞和炎症介质异常,从而造成肠黏膜组织损伤[9]。同样,CD4+、CD25+调节性T细胞异常活化也可导致促炎性细胞因子如TNF-α、IL-2、IL-6等的持续释放,抗炎性因子如IL-4、IL-10、IL-23等的异常降低,引起体内免疫反应过强[10]。通过测定动物血清中TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10的含量发现,相比于TNBS模型对照组,黄芪和麦冬复合多糖动物血清促炎性因子TNF-α、IL-2、IL-6水平降低,抗炎性因子IL-10水平升高。这些研究结果表明,黄芪和麦冬复合多糖可通过降低由巨噬细胞产生的促炎性因子如TNF-α、IL-2、IL-6水平,从而使得中性粒细胞无法向炎症部位聚集[11];另一方面,黄芪和麦冬复合多糖可通过提高T细胞来源的抑炎性因子如IL-10水平,进而刺激炎性细胞离开病变部位,并引起抗感染免疫应答,进而达到治疗溃疡性结肠炎的作用。

综上所述,黄芪与麦冬复合多糖对TNBS诱导的大鼠结肠炎具有一定的改善作用,其改善作用的发

挥可能与抑制促炎性因子和刺激抗炎性因子释放有关,但其深层机制有待进一步研究。

[1]宋璐,夏冰.溃疡性结肠炎发病机制及其诊断[J].中国实用内科杂志,2010,30(11):1056-1058.

[2]欧阳钦.溃疡性结肠炎的治疗[J].中国实用内科杂志,2010,30(4):383-385.

[3]Dharmani P,Chadee K.Biologic therapies against inflammatory bowel disease:a dysregulated immune system and the cross talk with gastrointestinal mucosa hold the key[J].Curr Mol Pharmacol,2008,1:195-212.

[4]姜琛璐,汤承,骞宇,等.黄芪多糖免疫调节作用研究进展[J].食品科学,2013,34(11):327-332.

[5]黄光辉,孙连娜.麦冬多糖的研究进展[J].现代药物与临床,2012,27(5):523-529.

[6]刘莉,梅其柄,周四元,等.大黄多糖对TNBS诱导大鼠结肠炎的治疗作用[J]. 中国中药杂志,2003,28(3):150-153.

[7]肖军,贺文成,李瑾,等.复方黄柏液对大鼠TNBS结肠炎的治疗机制探讨[J]. 胃肠病学,2009,14(8):78-82.

[8]李茹柳,迟莉,郭文峰,等.造模因素对TNBS致大鼠溃疡性结肠炎模型的影响[J]. 中药药理与临床,2007,23(6):208-211.

[9]曹秀红,张学彦,张晓娜.白介素在溃疡性结肠炎发病机制中的研究进展[J].世界华人消化杂志,2011,19(30):3143-3147.

[10]Li K,Yao S,Liu S,et al.Genetic poly morphisms of interleukin 8 and risk of ulcerative colitis in the chinese population[J].Clin Chim Acta,2009,405:30-34.

[11]解春静,庄彦华,栾雨茏.溃疡性结肠炎发病机制中免疫因素的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志2013,29(8):889-892.

2.1 黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导的大鼠结肠炎的治疗作用

实验过程中,模型对照组动物死亡3只,其他各组均无大鼠死亡。动物造模后24 h,动物出现稀便、肛周污秽严重、精神状态不佳、皮毛粗糙、摄食量明显减少及体重减轻等症状。由表2、图1可知,TNBS模型组动物解剖时可见结肠肿大,肠壁与肠系膜粘连,病理检查时动物结肠损伤处及结肠正常损伤交接处均可见黏膜缺失,中性粒细胞和淋巴细胞浸润、坏死,嗜酸性粒细胞浸润,隐窝腺扩张;黏膜下层大量纤维组织增生、水肿,中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润嗜酸性粒细胞浸润;浆膜层增生、水肿、巨噬细胞浸润等改变,而空白对照组动物结肠解剖时和病理学检查均未见病理改变,表明造模成功。黄芪和麦冬复合多糖和柳氮磺吡啶治疗后,动物摄食量增加,稀便血便减少,体重与TNBS模型组比较明显增加,炎细胞浸润、增生、水肿等炎症反应均明显减轻,结肠大体和组织病理学改变较TNBS模型组明显减轻,差异具有统计学意义(p<0.05)。

图1 各组大鼠结肠组织HE染色图(200×)Fig.1 HE dyeing figure of colon tissue(200×)注:A:空白对照组结肠黏膜层、黏膜下层、浆膜层形态完整,腺体排列整齐;B:TNBS模型对照组黏膜缺失,中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润、坏死,大量纤维组织增生；柳氮磺吡啶对照组(C)和黄芪和麦冬复合多糖组(D)炎细胞浸润、增生、水肿等炎症反应减轻。

2.2 黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导的结肠炎大鼠的胸腺和脾脏指数的影响

由表3可知,与空白对照组比较,TNBS模型组动物胸腺脏器重量及胸腺指数均小于空白对照组,脾脏重量及脾脏指数均大于空白对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。相比于TNBS模型组,柳氮磺吡啶对照组、黄芪和麦冬复合多糖组动物胸腺脏器重量及胸腺指数均大于模型对照组,脾脏重量及脾脏指数均小于模型对照组。这表明黄芪和麦冬复合多糖可通过保护TNBS造模大鼠的胸腺和脾脏进而达到改善大鼠溃疡性结肠炎的作用。

2.3 黄芪和麦冬复合多糖对TNBS诱导结肠炎大鼠血清细胞因子的影响

由表4可知,与空白对照组比较,TNBS模型组动物血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明显升高,IL-10水平明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05);与TNBS模型组比较,柳氮磺吡啶对照组、黄芪和麦冬复合多糖组动物血清TNF-α、IL-2、IL-6水平明显降低,IL-10水平明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。以上结果表明黄芪和麦冬复合多糖可通过调控大鼠血清中细胞因子的水平而达到改善大鼠结肠炎的目的。

3 讨论与结论

本实验结果表明,黄芪和麦冬复合多糖口服给药14 d治疗后,动物肠炎症状和体征均明显好转,各项炎症指标(动物体重变化、DAI、结肠大体和组织学

The ameliorative effects of astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides on TNBS induced colitis rats

QIAN Jiang1,LIANG Jin-qiang1,QIU Yu-wen1,WANG Yuan-yuan2,FU Xin-lu1,SONG Ying1,LIN Yue1,HUANG Zhi-ying1,*

(1.Laboratory Animal Center of Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510006,China;2.Infinitus(China),Jiangmen 510065,China)

Objective:To investigate the ameliorative effect of astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides compound on TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid)induced colitis. Methods:Forty SPF sprague-dawley rats were randomly assigned into four groups according to the weight,which were negative control group,TNBS model group,sulphasalazine control group,astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides group. In addition to the blank control group,colitis of rats was induced by rectal instillation of TNBS.When the colitis model on rats was established,blank control group was given intragastrically with 0.9% saline,sulphasalazine control group was given intragastrically with sulfasalazine suspension(150 mg/kg),astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides group was given polysaccharide(300 mg/kg)for 14 days.After 14 days of drug delivery,body weight and disease activity index(DAI)were evaluated,weighing the spleen and thymus organ,conducting the gross and histopathological examination on colon,detecting the serum TNF-α,IL-2,IL-6,IL-10. Results:Compared with the blank control group,body weight,thymus weight of the TNBS model group animals were significantly reduced(p<0.05).DAI,spleen weight,gross anatomy and tissue injury score of colon were significantly increased(p<0.05). TNF-α,IL-2,IL-6 levels of serum were significantly increased(p<0.05),IL-10 levels of serum was significantly decreased(p<0.05).On rats treated with the sulfasalazine,astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides,all the above mentioned indexes were significantly improved(p<0.05). Conclusion:Astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides has therapeutic effect on TNBS induced colitis of rats,and its therapeutic mechanism may be related to suppress the inflammatory cytokines(TNF-a,IL-2,IL-6)release and promote IL-10 release.

astragalus and ophiopogon japonicus polysaccharides;colitis;TNBS

2016-06-13

钱江(1987-)，男，硕士，研究方向：药物药理及毒理学，E-mail:qjmoto@126.com。

*通讯作者:黄芝瑛(1965-)，男，硕士，教授，研究方向：药物毒理学，E-mail:hzhiying@mail.sysu.edu.cn。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0354-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.059