黄芪口服液降低大鼠顺铂毒性作用机制的尿液代谢组学研究

宋慧婷 李长印 ��万瑶瑶 ��丁选胜 ��戴国梁 ��刘史佳 ��居文政

摘要采用基于液相色谱飞行时间质谱联用（LCTOFMS）技术的代谢组学方法，分析大鼠尿液内源性代谢物的变化，研究黄芪口服液（HO）降低大鼠顺铂（CDDP）毒性的作用机制。采用低剂量多次腹腔注射CDDP的方法建立CDDP染毒大鼠模型，并连续给予16天HO。于第18天收集正常对照（Control）组、顺铂模型（CDDP）组和黄芪口服液（HO）组大鼠的24h尿液，进行LCTOFMS分析，以获取尿液代谢物组数据集，对所得数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）等多元统计分析，以筛选潜在生物标志物。于第20天采集大鼠血清测定肌酐和尿素氮水平。血清指标测定结果表明，HO可以显著降低CDDP染毒大鼠的肌酐和尿素氮水平（p<0.05）。PCA得分图显示，3组可分别聚类，HO组位于Control组和CDDP组中间，表明HO可部分改善CDDP所致大鼠尿液代谢产物的异常变化。综合OPLSDA分析、t检验和倍数变化分析结果，最终共筛选并初步鉴定出35个尿液代谢产物作为HO减毒相关的潜在生物标记物。代谢通路分析结果表明，HO可通过纠正体内氨基酸代谢、能量代谢和核苷酸代谢等通路的紊乱，降低CDDP所致机体毒性。

关键词黄芪口服液；顺铂；尿液；代谢组学；液相色谱飞行时间质谱联用；毒性

1引言

顺铂（Cisdiaminedichloroplatinum，CDDP）对多种实体瘤具有良好的抗肿瘤疗效，基于CDDP的化疗方案目前依然是包括进展期非小细胞肺癌在内的多种癌症临床治疗的标准一线化疗方案[1]。虽然疗效确切，但CDDP多发的严重毒副作用，特别是剂量限制性肾毒性，极大地限制了其临床应用。因此，寻找能有效降低CDDP化疗毒性，同时不降低乃至可增加其抗癌活性的化疗辅助药物逐渐成为研究热点。研究表明，CDDP导致机体毒性的过程涉及到氧化损伤、细胞凋亡、炎症反应、线粒体机能失调、NO受体、内皮缩血管肽受体和肾血流量动力学变化等多条内外源通路和多个环节[2～4]。因此，理想的CDDP化疗保护剂也应该具有多环节多途径的解毒机制。

传统中药具有多成分、多途径、多靶点协同增效的整体作用特点，因此有望在防治CDDP机体毒性方面发挥独特优势。黄芪（Radixastragali）为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmebrananceus（Fisch.）Bge.和蒙古黄芪A.mongholicus（Bge.）Hsiao.的干燥根。性温，味甘，归肺、脾经。黄芪为常用补气中药，用药历史悠久，《神农本草经》将其列为上品。目前，黄芪以单味药或复方广泛应用于临床肿瘤治疗。临床研究显示，黄芪可增强肿瘤患者机體免疫力[5]，增强化疗效果[6]，降低化疗毒副反应[7]，改善患者的生活质量[8]。动物实验表明，黄芪可通过升高白细胞数和胸腺指数、脾指数，提高血清中IL2和TNFα的水平来增强荷瘤小鼠机体免疫功能[9]；也可通过促进Bax蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达来诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抑瘤效应[10]。因此，黄芪具有潜在的直接抗肿瘤作用，并可对抗化疗毒副作用，有望成为一种良好的CDDP化疗辅助用药。

代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化，研究生物体系的代谢途径的一种技术[11]，具有明显的整体反应性特点，与中药治疗疾病的多环节、多靶点、协同起效的整体观念十分吻合。近年来，越来越多的研究采用代谢组学方法考察中药治疗复杂疾病的药效及作用机理[12，13]，但目前尚无从整体作用角度研究黄芪降低CDDP所致机体毒性作用机制的报道。基于此，本研究采用基于LCTOFMS技术的尿液代谢组学方法，从大鼠尿液内源性代谢物组的变化角度，初步阐明临床常用黄芪制剂黄芪口服液（HO）降低CDDP毒性的作用及其机制。

2实验部分

2.1仪器与试剂

ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色谱质谱联用仪（美国ABSCIEX公司），配有MarkerViewTM和PeakViewTM等代谢组学研究相关软件、CDS质谱自动校准系统、Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Biofugeprimor冷冻高速离心机、AU5800生化仪（美国Beckman公司）。

甲醇和乙腈（HPLC级，德国默克公司）；甲酸和甲酸铵（HPLC级，美国Tedia公司）；肌酐和尿素氮测定试剂（美国Beckman公司）。SD大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，实验动物许可证：SCXK（沪）20130006。黄芪口服液（江苏省中医院院内制剂，产品批号：1501001，10mL/支）；注射用顺铂（CDDP，冻干型）源自齐鲁制药（海南）有限公司（批号：2WA2A1307047B，20mg/瓶）。实验用水为MilliporeMilliQAdvantageA10超纯水机制备的超纯水。

2.2动物实验及样品处理

雄性SD大鼠24只，随机均分为3组，分别为：（A）顺铂模型组（CDDPgroup）；（B）黄芪口服液组（HOgroup）；（C）正常对照组（Controlgroup）。适应1周后，A和B组均腹腔注射给予CDDP，给药时间分别为第1，3，7，11，14天，共计5次，每次剂量为2.5mg/kg；C组腹腔注射等量生理盐水。期间B组每日灌胃给予剂量为每只2mLHO，连续16天。于第18天搜集各组大鼠24h尿液，

70℃冻存备用；于第20天采集各组大鼠血清，采用BECKMANAU5800生化仪测定血清肌酐和尿素氮水平，采用单因素方差分析对测定结果进行统计分析。

样品分析前，室温解冻各尿液样品，涡旋混匀，吸取200μL，依次加入500μL甲醇，300μL水，涡旋振荡1min混匀，在4℃以12000g离心10min，取上清液进行LCMS分析。同时取每个尿样的上清液各20μL，涡旋混匀作为质控（QC）样品。

2.3色谱质谱条件及样品分析

色谱条件：Agilent1200液相色谱系统，色谱柱为Poroshell120SBC18（100mm×3.0mm，2.7μm），预柱为Poroshell120SBC18（5.0mm×3.0mm，2.7μm）。流动相A为含2mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸，流动相B为含2mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的甲醇/乙腈（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）。梯度洗脱：0～0.5min，5%B；0.5～12min，5%～100%B；12～16min，16～16.1min，100%～5%B；16.1～22min，5%B；1.3～16.5min切入质谱进行检测。流速：300μL/min，柱温：35℃，进样量：5μL，进样室控温：8℃。

质谱条件：采用ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色谱质谱联用仪进行检测，采用电喷雾离子化（ESI）源正负离子扫描模式，喷雾电压（ISVF）：正离子5400V，负离子

4500V；离子化温度（TEM）：550℃；雾化气（GS1）：60psi；辅助加热气（GS2）：60psi；气帘气（CUR）：35psi。一级质谱采集范围为m/z100～1000，累积时间0.250015s；DP：80V；CE：10eV。采用IDA模式采集二级质谱，采集范围为m/z50～1000，累积时间0.100006s，DP：80V；CE：35eV；CES：15；IRD为67；IRW为25。IDA转换标准为：信号强度>500cps，分子量误差50mDa，每个循环最多监测8个离子，在4Da内排除同位素。采用Analyst1.6.0软件控制LCMS分析系统，并采集分析数据。

样品采用上述LCTOFMS分析方法进行分析。为保证并监测分析系统稳定性，确保获取数据的可靠性，本实验首先连续进样5针QC样品以平衡色谱柱和系统，然后分析待测样品。每隔5个样品采用CDS系统自动校准一次，每隔10个样品插入一个QC样品。同时各组样品随机分布在整个分析批，以消除进样次序对分析结果的影响。

2.4数据处理

2.4.1数据有效性验证

根据QC样品中分布于不同保留时间的代表性离子的色谱峰强度、保留时间（tR）和质荷比（m/z）准确度信息，对仪器系统的稳定性和分析数据的质量进行评价，并为后续样品预处理参数设定提供依据。采用主成分分析（PCA）评估QC样品聚类效果，进一步验证分析数据的有效性和可靠性。

2.4.2预处理过程依据QC样品中代表性色谱离子的tR和m/z的误差范围设定参数，将LCMS原始数据导入Markerview软件中进行色谱峰的寻找和校准。根据tRm/z数据对应检测到的色谱峰的离子强度；根据80%原则及去除同位素离子获取有意义的连续性变量；采用色谱峰总面积归一化法对数据进行归一化处理。

2.4.3多元统计分析将预处理过的分析数据导入SIMCAP14.0中进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）。PCA用于验证分析系统性能的稳定性和分析数据的质量，并发现可能的逃逸样品。OPLSDA用于概览整个分析批的数据，并分辨出导致组间差异的变量。以OPLSDA模型中得到的投射变量影响值（Variableimportanceinprojection，VIP）的统计学差异阈值大于1作为标准筛选差异代谢物。同时，采用Markerview软件的t检验功能对预处理过的数据进行组间双侧独立样本t检验和倍数变化（Foldchange，FC）分析，以同时满足t检验的p<0.01和FC>2为标准筛选差异代谢物。选取上述两种筛选方法中的共同部分作为最终的差异代谢物。通过对比CDDP组与Control组和HO组间的共有差异代谢物，筛选变化趋势一致者作为HO缓解大鼠CDDP毒性作用的潜在生物标志物（Potentialbiomarkers，PBs）。

2.4.4生物标志物鉴定和代谢通路分析通过解析各个PB的母离子和子离子TOFMS图谱中蕴含的元素组成和化学结构信息，获得其相应的候选化合物列表；通过搜索匹配Chemspider，HMDB，METLIN，Massbank和KEGG等代谢组学相关数据库中的相应化合物及其MS/MS2级图谱，排除干扰的候选化合物，最终初步鉴定相应PB的化学结构。将包含峰强度信息的已鉴定PBs的数据集进行如下处理：（1）导入MultipleArrayViewer以生成热图，并进行HCA分析；（2）导入MetaboloAnalyst3.0中进行代谢通路分析，同时结合文献报道对生物标志物的生理学意义进行深入探讨。

3结果与讨论

3.1HO对CDDP模型大鼠的肌酐、尿素氮含量的影响

肾脏损害是CDDP最为常见的严重不良反应。血清中肌酐和尿素氮水平是反應肾功能的主要指标。如表1所示，给予CDDP后，大鼠血清中肌酐和尿素氮水平显著升高（p<0.01），而连续给予HO可显著降低CDDP导致的肌酐和尿素氮水平的升高（p<0.05），表现出明显的改善肾脏损伤作用。

3.2HO降低大鼠CDDP毒性的代谢〖ZH（组学研究

3.2.1代谢轮廓分析采用LCTOFMS进行尿液样本的分离和数据采集，图1分别展示了正、负离子模式下各组典型的总离子流色谱图（Totalionchromatograms，TICs）。由TIC图可知，CDDP组，HO组和Control组的图谱有一定差异。在对分析数据进行预处理前，首先需要对所获得的分析数据的质〖ZH）量和有效性进行验证。数据有效性验证结果表明，QC样品中分布于不同保留时间的代表性离子的色谱峰强度的RSD均小于10%，tR漂移均小于0.25min，m/z波动范围不超过0.000007；同时本批分析数据的PCA分析结果显示，PCA得分图（图2）中QC样品紧密聚集。由此可知，该批次样品分析过程中分析系统相对稳定，获得的分析数据基本可以反映样品的真实状态。

为了进一步考察其代谢轮廓变化，采用无监督的PCA方法处理LCMS数据，以表征组间差异。从PCA得分图（图2）可见：3组样品在不同的区域分别聚类，组间可明显区分，且HO组样品位于CDDP组和Control组之间，表明给予HO后可使CDDP所致的机体损伤向正常状态恢复。

3.2.2生物标志物的筛选和鉴定先后采用监督性的OPLSDA模式识别方法、组间双侧独立样本t检验和倍数变化分析对LCMS数据进行分析，以同时满足VIP>1，p<0.01和FC>2为标准筛选导致组间差异的尿液代谢产物。根据其在不同组间的含量变化趋势，共从中筛选出197个（正离子133个，负离子64个）差异代谢物作为HO缓解大鼠CDDP毒性作用的PBs。

采用2.5节方法对所有197个PBs进行初步鉴定。以PB3（m/z_tR为141.0658_2.39）正离子为例，根据其分子离子m/z141.0658的精确分子质量测定（误差在5mDa以内）及同位素匹配等原则可知，C6H8N2O2为其候选分子式；在METLIN和KEGG数据库中共有4个内源性代谢物Ethylimidazolecarboxylate，Methylimidazoleaceticacid、Gaboxadol和1，3Dimethyluracil与此分子式相对应。如图3所示，在PB3的二级图谱中，其分子离子可先后丢失18Da（H2O）和28Da（CO），表明其化学结构中含有羧基，据此可以排除候选化合物Ethylimidazolecarboxylate、Gaboxadol和1，3Dimethyluracil。而可归属为咪唑环的特征碎片的m/z为68.0516的碎片离子的存在，可进一步证明该图谱应为Methylimidazoleaceticacid的二级图谱。借助TOFMS的精确分子质量测定和Peakview软件的fragmentsPane功能，我们对PB3的特征碎片离子进行了合理归属（如图3所示）。需要指出的是，上述步骤并不能保证PBs的唯一归属，尚需参考相关文献报道来确认鉴定结构。最终，通过匹配METLIN等数据库，解析2级图谱和参考相关报道，初步鉴定了35个PBs。表2总结了35个PBs的详细信息，包括离子类型、质荷比、保留时间、分子式、化合物名称、CDDP组与Control组相比的变化趋势、VIP值、p值、FC值等。

将包含35个PBs化合物名称和相对色谱峰强度的数据导入MultipleArrayViewer软件，经lg2转化后进行HCA聚类分析生成其相应的热图（图4）。由图4中颜色变化可以清晰地看到，给予CDDP后，各个PBs在尿液中的含量与Control组相比出现了明显变化，而给予HO可改善这些改变；树状分支图显示了各个样品间的亲缘关系，由此可知，HO大体位于CDDP和Control中间，形象地反映了HO改善CDDP所致损伤的作用。

3.3代谢通路分析及其生物学意义探讨

将包含35个PBs化合物名称和相对色谱峰强度的数据导入MetaboloAnalyst3.0中进行代谢通路分析，如图5所示，有6条显著改变（p>0.05）的代谢通路，分别对应12个已鉴定的PBs。而通过HMDB和KEGG等数据库及文献搜索可知，剩余21个PBs对应于7条通路（详见表2中的PA14～20）。这些通路的紊乱与回调与CDDP的机体毒性及HO的解毒作用机制紧密相关。

氨基酸是机体的重要营养物质，和蛋白质及多肽一样，氨基酸代谢对于机体的生长、繁殖及免疫等而言至关重要[14]。标志物鉴定结果（表2）表明，共有16个潜在生物标志物可能与9条氨基酸生物合成及代谢通路相关，其中13个在给予CDDP后浓度水平显著上调，而在给予HO后可明显下降，说明连续给予HO可回调CDDP导致〖CM（44的机体氨基酸代谢通路紊乱。而代谢通路分析（图5）结果显示，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代谢〖CM）

通路为改变最为显著的代谢通路，且有多达12个潜在标志物与此通路相关（图6）。由此可知，回调苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代谢通路的紊乱为HO降低CDDP机体毒性的主要作用途径之一。此外，给予CDDP后Allysine[15]和4Pyridoxicacid的下调，表明CDDP会导致机体维生素B6代谢通路紊乱。而维生素B6是机体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系[16]。由此可以推测，CDDP导致的氨基酸代谢紊乱可能与维生素B6代谢紊乱有关。

脂肪酸是细胞膜的重要组成成分和体内最大的能量储备物质。据报道，单一剂量的CDDP会导致细胞内钙非依赖性磷脂酶A2的激活和线粒体脂肪酸氧化的抑制，最终会使非酯化脂肪酸和甘油三酯在血清、尿液和肾脏组织内积累[17]。由表2和图6可知，给予CDDP后，有3个脂肪酸类代谢产物（PB16，PB27，PB35）出现明显上调，这与之前的研究报道一致；同时也发现1个脂肪酸类代谢产物（PB26）下调。

煙酸及烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解等过程。因此，给予CDDP后3个烟酸和烟酰胺通路相关代谢物的含量上调（PB23和PB24）或下降（PB21），提示可能存在脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢通路紊乱；而三羧酸循环代谢产物PB9的上调进一步表明CDDP导致了三羧酸循环的紊乱。而这些现象与先前有关CDDP可导致机体线粒体机能失调，继而引发ATP合成障碍，造成机体能量代谢紊乱的报道相一致[18]。

根据VIP值大小可判断代谢物对组间差异的贡献度。将表2中所有35个PBs按VIP值重新排序发现，共有15个PBs的组间对比VIP值均大于2，表明与这些PBs相关的代谢通路与HO改善CDDP毒性作用最为相关。而在这15个PBs中，除了11种化合物与上述的氨基酸代谢和能量代谢紊乱外，另有PB25（VIP排名第2）与嘌呤代谢相关，PB4，PB1和PB14（VIP排名第7，11，12）与嘧啶代谢相关，它们在给予CDDP后均显著升高，而在给予HO后又可显著回调，这表明回调核苷酸代谢的异常激活可能为HO降低顺铂毒性的主要作用机制之一。

基于上述分析，根據文献报道和KEGG数据库信息，可将HO减弱顺铂所致大鼠机体毒性所涉及到的体内主要代谢通路网络总结如图6所示，HO主要可通过调节机体苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代谢、脂肪酸代谢、三羧酸循环、维生素B6代谢、烟酸烟酰胺代谢、嘌呤和嘧啶代谢等通路的紊乱，恢复机体氨基酸、能量和核苷酸的代谢平衡，发挥其降低CDDP机体毒性的作用。

4结论

本研究采用基于LCTOFMS的尿液代谢组学研究方法，从整体水平代谢产物轮廓层面证明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用，并从尿液中筛选鉴定出35个表征HO减毒作用的PBs。本研究初步阐明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用机制主要与改善机体氨基酸、能量和核苷酸代谢相关。

References

1StathopoulosGP.BUON，2013，18（3）：564-569

2DosSantosNA，CarvalhoRodriguesMA，MartinsNM，dosSantosAC.Arch.Toxicol.，2012，86（8）：1233-1250

3YangY，LiuH，LiuF，DongZ.Arch.Toxicol.，2014，88（6）：1249-1256

4HelmyMW，HelmyMM，AbdAllahDM，AboZaidAM，MohyElDinMM.J.Physiol.Pharmacol.，2014，65（3）：393-399

5GUANGuoJing，WANGXiuLing.JournalofMedicalForum，2011，（7）：16-17，20

贯国京，王秀玲.医药论坛杂志，2011，（7）：16-17，20

6ZHANGXiaoFeng，CAIYuanXun.ChineseJournalofSurgeryofIntegratedTraditionalandWesternMedicine.，2011，（1）：82-83

张小风，蔡元训.中国中西医结合外科杂志，2011，（1）：82-83

7LUOMan，FENGJuePing，PUJiaJun，XIETao，FANGJing，LIMin.JournalofHubeiVniversityofTraditionalChineseMedicine，2012，（3）：49-50

骆曼，冯觉平，卜佳珺，谢涛，方静，李敏.湖北中医药大学学报，2012，（3）：49-50

8PANGYaPing.ChinaModernMedicine，2010，（29）：44-45

庞亚萍.中国当代医药，2010，（29）：44-45

9LILianKun，KUANGWenJuan，HUANGYunFeng，XIEHanHong，ZHOUQingChun，CHENGuo，WANGBinRong，WANLiHong.SichuanJournalofPhysiologicalSciences，2011，（1）：14-16

李连琨，匡文娟，黄云峰，谢旱红，周青春，陈果，王滨容，万莉红.四川生理科学杂志，2011，（1）：14-16

10LILianKun，HUANGYunFeng，XIEHanHong，CHENGuo，WANGBinRong，KUANGWenJuan，WANLiHong.ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae，2011，（17）：188-190

李连琨，黄云峰，谢旱红，陈果，王滨容，匡文娟，万莉红.中国实验方剂学杂志，2011，（17）：188-190

11NicholsonJK，ConnellyJ，LindonJC，HolmesE.Nat.Rev.DrugDiscov.，2002，1（2）：153-161

12PIZiFeng，MENLiHui，ZHANGJing，ZHOUYuan，SONGFengRui，LIUZhiQiang.ChineseJ.Anal.Chem.，2015，43（2）：169-175

皮子凤，门丽慧，张静，周园，宋凤瑞，刘志强.分析化学，2015，43（2）：169-175

13WEIYing，WANChuanLing，XUERong，LIXiaoJing，ZHANGWenJun，PEIFengKui.ChineseJ.Anal.Chem.，2016，44（6）：857-863

魏莹，万传玲，薛蓉，李晓晶，章文军，裴奉奎.分析化学，2016，44（6）：857-863

14WuG.AminoAcids，2009，37（1）：1-17

15TaneN，TakedaT，ShiojiT，OhyamaH，ItohH.J.Nutr.Sci.Vitaminol.，1976，22（2）：105-114

16BrownRR.Am.J.ClinicalNutri.，1971，24（2）：243-247

17PortillaD，LiS，NagothuKK，MegyesiJ，KaisslingB，SchnackenbergL，SafirsteinRL，BegerRD.KidneyInter.，2006，69（12）：2194-2204

18KimSH，ChoSK，HyunSH，ParkHE，KimYS，ChoiHK.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2011，75（6）：1090-1097

AbstractAliquidchromatographyquadrupoletimeofflightmassspectrometer（LCQ/TOFMS）basedurinarymetabolomicapproachwasemployedtoassessthetoxicityalleviationeffectofHuangqioralsolution（HOs）oncisplatinexposedratsandexploreitspossiblemechanisms.Rattoxicitymodelwasdevelopedbymultipleintraperitonealinjectionoflowdosecisplatin，whileHOswasorallyadministratedtoratssimultaneouslyfor16consecutivedaystoattenuateorreducethecisplatininducedtoxicity.24hoururinesamplesonday18werecollectedandanalyzedusingLCQ/TOFMStoobtainthedatasetofurinarymetabolites.Principalcomponentanalysis（PCA）andorthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis（OPLSDA）wereemployedtoassessthequalityofthedatasetandscreenthepotentialtoxicityalleviationbiomarkers.Theserumlevelofratcreatinineandureanitrogenonday20wasdetermined，andtheresultsshowedthatsuccessiveadministrationofHOssignificantlyreducedthecisplatininducedincreaseofcreatinineandureanitrogen.PCAclusteranalysisclearlydemonstratedthatHOscouldpartlyimprovetheCDDPinducedabnormalityofmetabolicprofiling.35urinarymetaboliteswerefinallyscreenedasthepotentialbiomarkersassociatedwiththetoxicityattenuationeffectofHOs，accordingtothecombinationoftheanalysisresultsofOPLSDA，ttestandfoldchangeanalysis.FurthermetabolicpathwayanalysisrevealedthatHOscouldrestorethemetabolicdisordersofaminoacid，energyandnucleotide，therebyexerteditstoxicityalleviationeffect.

KeywordsHuangqioralsolution；Cisplatin；Urine；Metabolomics；Liquidchromatographytimeofflightmassspectrometry；Toxicity

（Received1November2016；accepted30December2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81503300）.