抗菌肽CGA-N12对腹腔注射热带念珠菌小鼠的治疗作用

李瑞芳，李超楠，陆志方，张慧茹，张瑞玲，刘政伟

(河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001)



抗菌肽CGA-N12对腹腔注射热带念珠菌小鼠的治疗作用

李瑞芳，李超楠，陆志方，张慧茹，张瑞玲，刘政伟

(河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001)

CGA-N12为嗜铬粒蛋白A的N端65-76位氨基酸组成的衍生肽，前期研究表明，CGA-N12具有特异性抗念珠菌活性，尤其对临床病原真菌热带念珠菌拮抗活性最强。为研究CGA-N12体内抗真菌活性，建立了热带念珠菌深部感染小鼠模型，分别用每日15 mg/kg和30 mg/kg的CGA-N12对小鼠进行治疗，并设每日15 mg/kg伊曲康唑治疗对照组和感染对照组。通过测定治疗后小鼠存活率、体重变化、肾脏载菌量，以及组织器官病理变化，判断CGA-N12对小鼠的治疗效果。结果表明，每日15 mg/kg和30 mg/kg的CGA-N12治疗14 d后与感染对照组相比，小鼠肾脏载菌量分别降低97.6%和99.1%，小鼠存活率分别提高40%和45%，体重分别增加1.3 g和5.9 g，免疫器官指数均显著增加，而与治疗对照组差异不显著。病理切片观察，每日15 mg/kg和30 mg/kg的CGA-N12对组织器官的病变均有明显改善，并且没有出现伊曲康唑治疗后产生的肝小叶血管内皮细胞增生和肾出血现象。结果表明，CGA-N12对热带念珠菌深部感染小鼠具有治疗作用。

抗菌肽；CGA-N12；热带念珠菌；体内抗真菌活性

随着肿瘤、艾滋病、糖尿病、血液病和老年疾病等发病率的不断上升，以及器官和骨髓移植技术、导管技术等检查治疗手段的开展，真菌感染尤其是深部真菌感染日益增多[1]。念珠菌属是侵袭性感染中最常见的真菌病原体，几乎40%的传播性念珠菌病是致命的[2]。深部真菌病致死率高于疟疾和肺结核，每年约150万人死于深部真菌病[3]。广谱抗生素、类固醇和细胞毒素类药物的广泛应用，使念珠菌的耐药性不断升高，这也是导致念珠菌病发病率上升的重要原因之一[4]。除了常见的烟曲霉菌、白念珠菌、热带念珠菌和新生隐球菌，以前对现有抗真菌药物敏感性极低的镰孢属、赛多孢属和接合菌，现在也成了致病性较高的真菌[1]。由于念珠菌耐药性的增长速度远远高于新型抗真菌化合物的研发速度，新型抗菌药物的研发显得非常迫切和必要[5]。

抗菌肽是由基因编码的两亲性多肽。抗菌肽形成的先天免疫为机体对抗病原菌提供了第一道防线。这种免疫形式在目前所存在的物种中均有发现，具有广谱抗菌活性[6]，对多种微生物包括细菌、真菌、病毒，甚至是肿瘤细胞均有抑制作用。能杀死耐药性真菌也是它们的主要优点之一[7]。与传统的抗菌药物相比，抗菌肽具有水溶性和热稳定性好、无免疫原性、作用温和、细胞毒性小、不易产生耐药性等优点[8]。

嗜铬粒蛋白A是人体内分泌细胞中的一种蛋白质，由31-76位氨基酸组成的CGA-N46具有特异抗念珠菌活性[9]，但抗菌活性不强，对CGA-N46进行结构改造，发现由嗜铬粒蛋白A N端65-76位氨基酸组成的衍生肽CGA-N12的结构稳定，抗菌活性高，安全性好[10]，对热带念珠菌的抗菌活性最高[11]。本文在前期研究的基础上，建立了热带念珠菌深部感染小鼠模型，研究CGA-N12对热带念珠菌感染小鼠的临床治疗效果，为将CGA-N12开发成新型抗菌肽提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和菌种 SPF级昆明小鼠，购自河南省实验动物中心，雌雄各半，体重20 g±2 g。采用常规饲养，自由摄食、饮水，环境温度16℃～22℃，自然光照。试验开始前，小鼠常规饲养7 d，以适应试验环境。热带念珠菌，郑州大学第一附属医院检验科惠赠，为临床分离株。

1.1.2 药品 CGA-N12，河南工业大学生物工程学院微生物与生化药学实验室采用Fmoc固相合成法合成，反相高效液相色谱法纯化，纯度95%以上；伊曲康唑注射液(商品名：斯皮仁诺)，西安杨森制药公司产品；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司产品；以上药品均用PBS(pH7.0，0.20 mmol/L)配制成所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 热带念珠菌的复壮 挑取热带念珠菌单菌落接种于SD培养基中，28℃、180 r/min培养14 h。随机挑选3只小鼠，腹腔注射热带念珠菌液300 μL。24 h后，将小鼠脱颈处死，750 mL/L无水乙醇中浸泡5 min，无菌条件下解剖小鼠，从小鼠腹腔中吸取黏液接种于含双抗的SD培养基中。重复上述步骤，直到小鼠在注射菌液后12 h内出现死亡，即得到热带念珠菌的复壮株。

1.2.2 热带念珠菌深部感染最佳浓度确定 随机挑选40只雌性小鼠，每日以200 mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺1次，连续注射3 d。在最后一次给药24 h后，随机分为4组，每组10只。第1组腹腔注射浓度为106CFU/mL的菌液 200 μL，第2组注射107CFU/mL的菌液200 μL，第3组注射108CFU/mL的菌液 200 μL，第4组注射109CFU/mL的菌液200 μL，10 d后观察各组小鼠行为反应及死亡情况,并进行统计分析。感染10 d后，小鼠出现体重严重下降、脊背弯曲、身体蜷缩、精神萎靡、行动蹒跚等症状，死亡率在50%左右，剖检出现热带念珠菌系统性感染症状，肾脏能分离出热带念珠菌，判定为建立深部感染的最佳浓度。

1.2.3 小鼠深部感染模型的建立 随机挑选80只雌性小鼠，以200 mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺，每日1次，连续注射3 d，24 h 后，腹腔注射最佳感染浓度的新鲜热带念珠菌悬液 200 μL，建立热带念珠菌深部感染小鼠模型。

1.2.4 热带念珠菌深部感染小鼠的治疗 热带念珠菌感染10 d左右，随机剖检小鼠，肾脏分离热带念珠菌。此时开始治疗，记录为试验起始时间。将小鼠随机分为4组，每组20只，第1、2组为试验组，每日分别腹腔注射CGA-N12 15 mg/kg和 30 mg/kg，第3组治疗对照组，每日腹腔注射伊曲康唑15 mg/kg；第4组为感染对照组，每日1次腹腔注射200 μL PBS(0.2 mmol/L，pH7.0)。连续治疗 2 周。

1.2.5 治疗效果判断

1.2.5.1 小鼠肾脏载菌量的测定 随机取感染后10 d、治疗7 d和14 d小鼠，每组3只，脱颈处死后，750 mL/L乙醇浸泡3 min。无菌条件下剖检，摘取小鼠肾脏，称肾脏重量。将肾脏置于无菌匀浆器中，加入 2 mL PBS，匀浆肾脏至无颗粒。吸取 100 μL 肾脏匀浆液，于含双抗的SD固体培养基上涂板，培养24 h后记录培养基上菌落个数。

1.2.5.2 免疫器官指数测定 分别在用药后3、5、7、10、12、14 d，脱颈处死小鼠，称体重，剖检，取脾脏、胸腺称重，计算脾指数和胸腺指数。脾指数=脾重量(mg)/小鼠体重(g)，胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)。

1.2.5.3 组织切片观察 分别在用药3、5、7、10、12、14 d脱颈处死小鼠，无菌剖检，分别取小鼠肝、肺、脾和肾，观察并记录各组织器官形态和颜色变化，将各组织修剪固定，制作石蜡切片[12]，观察各组织病理学变化。

2 结果

2.1 热带念珠菌深部感染小鼠模型的建立

健康昆明小鼠接种不同浓度热带念珠菌悬液，感染10 d后，各组小鼠存活率见表1。

表1 不同浓度热带念珠菌深部感染小鼠存活率

剖检109CFU/mL试验组小鼠，均可见热带念珠菌系统性感染症状，具体表现为肝脏和肾脏布满白色斑点。取肾脏匀浆涂板，平板上长出肉眼可见热带念珠菌菌落。因此，判定热带念珠菌深部感染小鼠模型成立，感染热带念珠菌最佳浓度为109CFU/mL。

2.2 治疗效果

2.2.1 治疗小鼠的载菌量 系统性真菌感染小鼠模型中，肾脏是真菌感染的主要靶器官。取感染后10 d、治疗7 d和14 d 的小鼠肾脏，匀浆涂板，并计算治疗14 d后，CGA-N12对热带念珠菌的抑制率，结果见表2。

从表2可以看出，感染10 d后，各试验组肾脏载菌量差异不显著。治疗7 d后，感染对照组载菌量不断增加，与1、2、3组小鼠肾脏载菌量差异显著。随治疗时间的增加，1、2、3组小鼠肾脏载菌量逐渐减少，治疗14 d，每日30 mg/kg组肾脏载菌量减少99.1%，而感染对照组4组载菌量仍在增加。结果表明，CGA-N12在小鼠体内具有较强的杀菌活性。

表2 CGA-N12对热带念珠菌深部感染小鼠肾脏载菌量的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.2.2 存活率 治疗期间，对照组小鼠精神萎靡、被毛无光泽，行动蹒跚,食欲降低，存活率仅有55%；CGA-N12治疗组在试验后期小鼠活跃，死亡减少， 每日15 mg/kg试验组在治疗7 d时死亡1只(表3)，存活率为95%，每日30 mg/kg试验组存活率为100%，与伊曲康唑治疗对照组相同(图 1)。

2.2.3 体重 治疗期间，感染对照组小鼠平均体重减少4.3 g， 每日15 mg/kg试验组平均体重增加1.3 g，每日30 mg/kg试验组平均体重增加5.9 g，伊曲康唑治疗对照组体重增加4.9 g(表4，图2)。CGA-N12能够使深部感染小鼠体重显著提高，与伊曲康唑治疗组差异不显著。

表3 CGA-N12对热带念珠菌深部感染小鼠存活量的影响

图1 CGA-N12对热带念珠菌深部感染小鼠存活率的影响

表4 CGA-N12对热带念珠菌感染小鼠体重的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.2.4 免疫器官指数 免疫器官是生物体免疫和抵抗病原菌感染入侵的器官。药理学实验中常以药物对免疫器官重量的影响作为衡量实验动物免疫功能强弱的指标。本试验通过测定各组小鼠胸腺和脾脏的指数变化，研究 CGA-N12对深部感染热带念珠菌小鼠免疫器官的影响。胸腺指数变化结果见表5和图3；脾脏指数变化结果见表6和图4。

从图3和图4可以看出，与感染对照组相比，从第9天开始，治疗组胸腺指数显著增加，CGA-N12的治疗作用具有浓度依赖性。随着治疗时间的延长，各治疗组间差异不显著。感染小鼠脾指数从CGA-N12治疗第5天开始就显著提高，治疗组间差异不显著。但与感染对照组相比，免疫器官指数明显提高，差异显著(P<0.05)。

图2 CGA-N12对热带念珠菌感染小鼠体重的影响

表5 CGA-N12 对热带念珠菌感染小鼠胸腺指数的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

图3 CGA-N12 对热带念珠菌感染小鼠胸腺指数的影响

2.2.5 感染小鼠组织器官病理切片观察 对各组

存活小鼠的组织器官进行病理切片观察(图5)，正常组肝小叶完整，肝索清晰可见；脾小体结构清晰，红髓白髓界限明显；肺泡结构清楚，肺泡腔内无浸润；肾脏有典型的肾小球结构，无炎性出血。感染对照组肝索结构不清楚，肝血窦中血细胞较多；脾脏切片看不到正常的脾小体结构，红髓白髓界限模糊；肺泡变形，严重充血；肾脏炎性细胞浸润，肾小管损伤及再生。每日15 mg/kg和30 mg/kg两个剂量的CGA-N12经过14 d的治疗后治疗效果相近。与感染对照组相比，肝、脾、肺、肾恢复正常。而伊曲康唑治疗对照组，小鼠肝小叶血管内皮细胞增生，肾脏有明显的炎性出血。因此，与伊曲康唑相比，CGA-N12具有明显的生物安全性。

表6 CGA-N12 对热带念珠菌感染小鼠脾指数的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

图4 CGA-N12 对热带念珠菌感染小鼠脾指数的影响

3 讨论

伊曲康唑(商品名：斯皮仁诺)是一种合成的三唑类广谱抗真菌药物，是目前治疗真菌病常用的药物，常用于治疗甲真菌病、皮肤真菌感染、泌尿生殖系统真菌感染等[13]。不过，临床使用伊曲康唑造成的不良反应也不容忽视。Wang J L等[14]对39个研究中的8 000多个病人进行汇总发现： 由于肝中毒，有1.5%的病人停止了伊曲康唑治疗，19.7%的伏立康唑使用者和17.4%的伊曲康唑使用者血清肝酶水平升高。杨忠慧[15]对关于伊曲康唑导致的不良反应的184例文献进行分析发现,伊曲康唑会导致肾脏损伤，52例患者中，肾功能损害发生率为9.61%。本试验验以伊曲康唑作为CGA-N12治疗小鼠时的治疗对照，通过观察小鼠组织器官病理切片发现，治疗14 d后，每日15 mg/kg和30 mg/kg两种剂量的CGA-N12均达到与每日15 mg/kg伊曲康唑相同的治疗效果，但与正常肝、肾组织切片相比，伊曲康唑治疗组肝脏组织肝小叶血管内皮细胞增生，肾脏有明显出血。CGA-N12表现出更高的生物安全性。

图5 CGA-N12 对热带念珠菌感染小鼠组织的影响(HE，400×，病理变化如箭头所示)

卢亚丽等[9]对CGA-N46的抗菌谱进行测定，发现CGA-N46抑制克柔念珠菌的作用最强。李瑞芳等[11]研究发现CGA-N12的敏感菌为热带念珠菌。张琳等[16]测定了CGA-N46对克柔念珠菌深部感染小鼠的临床治疗效果，发现每日60 mg/kg的CGA-N46治疗感染小鼠的效果最佳，治疗14 d几乎可以使小鼠肺、肝、脾组织恢复至正常状态，小鼠存活率为95%。本研究发现，每日15 mg/kg的CGA-N12对热带念珠菌深部感染的小鼠治疗14 d时，就可使小鼠内脏恢复至正常状态，且小鼠存活率为100%。因此，CGA-N12作为CGA-N46的衍生肽比母肽的抗菌活性有很大的提高。另外，CGA-N12没有出现伊曲康唑所具有的肾毒性，因此，CGA-N12具有非常大的潜力可以成为新型抗菌药物。

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Curative Effect of Antifungal Peptide CGA-N12 on Mice Systemically Infected withCandidatropicalis

LI Rui-fang，LI Chao-nan，LU Zhi-fang，ZHANG Hui-ru，ZHANG Rui-ling，LIU Zheng-wei

(CollegeofBiologicalEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou,Henan,450001,China)

CGA-N12,a derived peptide of chromogranin A which consists of the 65th to 76th amino acids,has specific antifungal activity,especially to clinical pathogenic fungusCandidatropicalis.The study was designed to research the antifungal activity of CGA-N12invivo.The mouse model systemically infected withCandidatropicaliswas established by injecting clinical isolated strain ofCandidatropicalisvia intraperitoneal.15 mg/kg and 30 mg/kg CGA-N12 were applied for treatment,respectively.We set 15 mg/kg itraconazole-treated mice as therapeutic control group and PBS-treated mice as infected control group.The survival rate,the changes of body weights and theCandidas-loading amount of kidney were calculated;pathological lesions of tissues and organ with HE staining were observed.The results showed that,compared with control group,after treatment with 15 mg/kg and 30 mg/kg CGA-N12 for 14 d,theCandidas-loading amount of kidney reduced 97.6% and 99.1%,the survival rate increased 40% and 45%,the average body weight increased 1.3 g and 5.9 g,and the immune organ indexes increased significantly,respectively.The difference of the results between 30 mg/kg CGA-N12 and 15mg/kg/d itraconazole was not significant.The results of pathological lesions showed that 15 mg/kg and 30 mg/kg CGA-N12 both had therapeutic activity on the organ lesions of the infected mice and had no proliferation of hepatic vessel endothelial cell hyperplasia and renal hemorrhage which were found in itraconazole treated group.In conclusion,CGA-N12 has therapeutic activity on the mice systemically infected withCandidatropicalis.

antifungal peptide；CGA-N12；Candidatropicalis；antifungal activityinvivo

2016-07-25

国家自然科学基金项目(31071922,31572264)；河南省省属高校基本科研业务费专项资金项目(2015RCJH03)

李瑞芳(1971-)，女，河南南乐人，教授,博士，主要从事微生物与生化药学研究。

S859.796.7;S852.661

A

1007-5038(2017)04-0062-06