肿瘤相关巨噬细胞在三阴性乳腺癌中的表达与临床病理因素及预后关系的研究

余长艳 甄丽娜 李洪滨 张 悦 张清媛

·基础研究·

肿瘤相关巨噬细胞在三阴性乳腺癌中的表达与临床病理因素及预后关系的研究

余长艳 甄丽娜 李洪滨 张 悦 张清媛

目的探讨肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)在三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中的表达及其与临床病理因素和预后的关系。方法 应用免疫组化染色法检测108例TNBC组织中TAMs的表达情况，同时检测癌组织中微血管密度(Microvessel density，MVD)，分析TAMs表达与TNBC临床病理参数、MVD及预后的关系。结果 TAMs表达与患者年龄无关，与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、TNM分期及MVD密切相关。生存分析显示TAMs与TNBC术后5年无病生存时间(Disease-free survival，DFS)及总生存时间(Overall survival，OS)相关；MVD与5年DFS相关，而与OS未见相关性。Cox回归分析示TAMs是TNBC预后不良的独立危险因素。结论 TAMs高表达提示TNBC预后不良，TAMs可成为判断预后的免疫指标之一。TAMs与MVD密切相关，可能通过促进瘤内血管增生，从而促进TNBC的生长、侵袭和转移，进一步影响TNBC患者的预后。

三阴性乳腺癌；肿瘤相关巨噬细胞；微血管密度；预后

肿瘤微环境对乳腺癌的发生、发展至关重要。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是肿瘤微环境中重要成分，所占比例可达间质细胞的50%～80%。研究表明众多人类肿瘤中均有TAMs的浸润，TAMs与恶性肿瘤的发生、浸润转移及预后关系密切；此外，TAMs可分泌促血管生成因子如VEGF，促进肿瘤血管网的建立，为肿瘤的生长提供营养及转移通路[1]。我们既往研究证明，TAMs在乳腺癌中的浸润与腋下淋巴结阴性乳腺癌患者预后密切相关[2-3]。但是，其在三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中的表达尚不明确。TNBC是乳腺癌中的一种特殊类型，目前对于TNBC中TAMs的表达及预后意义的研究较少，尚无TAMs与微血管密度(Microvessel density，MVD)关系的报道。本研究中我们利用免疫组织化学染色法检测108例TNBC中TAMs的表达，并分析其表达与临床病理因素、生存预后及与MVD的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2006年1月—2008年12月于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院行乳腺癌改良根治手术、临床病理及预后资料完整的TNBC标本108例。所有标本经病理科医生确诊为浸润性导管癌，术前均未接受过化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗。手术方式为改良根治术或保乳手术。主要排除标准为患者在确诊时存在远处转移、局部进展期疾病、炎性乳癌，双乳癌及失访病例。患者均为女性，年龄范围32～75岁，中位年龄51岁；患者随访至少5年或至患者死亡。

1.2 实验试剂

鼠抗人单克隆CD68抗体(ZM-0464)、鼠抗人单克隆CD34抗体(ZM-0046)、增强型二步法检测试剂盒(PV6002)、DAB显色剂(ZLI-9018)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

TAM染色方法为常规ABC免疫组化法。组织蜡块4 μm连续切片，脱蜡水化后，置入柠檬酸缓冲液中，高温高压或微波技术行抗原修复，消除内源性过氧化物酶，组织滴加适当比例稀释的一抗(CD68、CD34)，后滴加羊抗鼠的IgG/HRP聚合物标记二抗，显色剂显色，苏木素复染，封片。以已知染色阳性的乳腺癌切片为阳性对照，用PBS缓冲液取代一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

TAMs：CD68阳性细胞的判定即TAMs的计数方法参照国外学者提供的方法进行。以细胞浆含棕黄色颗粒者为阳性细胞，观察5个高倍镜视野，计数该区域阳性细胞数目，其均值为该病例数值。以TAM表达中位数为阈值，将样本分为2组，高于中位数的为TAM高表达组(TAM≥45.5个/高倍视野)，低于中位数的为TAM低表达组(TAM<45.5个/高倍视野)。

MVD：CD34染色判定即MVD的判断标准参考Weidner微血管计量方法。每一个染成棕黄色的，视为一个单一可计数的微血管，观察5个高倍镜视野，计数该区域阳性细胞数目，其均值为该病例数值。以MVD的中位值为划分基准，将样本分为2组，高于中位值的定义为MVD高表达组(MVD≥29.05个/高倍视野)，低于中位值的为MVD低表达组(MCD<29.05个/高倍视野)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析。TAMs、MVD与临床病理因素相关性的检验采用Spearman相关性分析，TAMs与MVD相关性采用Rearson相关性分析，生存分析应用Kaplan-Meier法进行，Log-rank检验用来比较两组生存期的差异，应用Cox多因素模型进行预后分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TAMs和MVD在TNBC组织中的表达情况

TAMs染色阳性主要为细胞膜及细胞浆内出现棕黄色或黄褐色颗粒，108例TNBC中，TAMs表达中位值为45.5，以此为阈值将患者分成2组：TAMs高表达组54例(图1A)，TAM低表达组54例(图1B)。CD34标记的MVD呈现棕褐色，阳性染色定位于血管内皮细胞，108例TNBC中MVD的中位值为29.05，将大于中位值的肿瘤血管密度定义为高血管密度(图1C)，反之则为低血管密度(图1D)。

2.2 TAMs及MVD表达与TNBC临床病理因素的关系

本研究发现TAMs表达与患者年龄无关，而与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、TNM分期密切相关，即体积较大(P=0.010)、存在淋巴结转移(P=0.012)、分化差(P=0.006)、TNM期别高(P<0.01)的肿瘤存在TAM高表达(表1)。三阴性乳腺癌患者的临床特征见表2。

图1 TNBC中TAMs和MVD的表达Figure 1 Immunohistochemical detection of TAMs(marker CD68)and MVD(marker CD34)in TNBC tissues

表1 TAMs、MVD与临床病理因素的关系Table 1 Correlation between CD68 /CD34 expressions and various clinicopathological features

表2 三阴性乳腺癌的临床特征Table 2 Clinical characteristics of the patients with TNBC

2.3 TAMs及MVD表达与TNBC预后的关系

经Log-rank检验分析发现TAM高表达TNBC患者，其5年DFS(P=0.008)及OS(P=0.022)显著低于TAM低表达组(图2)。MVD高的患者，其5年DFS显著低于MVD低的患者(P=0.040)，但与OS未见相关性(P=0.445)(图3)。

2.4 Cox单因素及多因素分析

Cox单因素分析显示年龄、淋巴结转移状态及TAM表达与预后相关。多因素分析显示淋巴结存在转移及TAM高表达是乳腺癌预后不良的独立危险因素(表3)。

2.5 TAMs与MVD的相关性

应用Pearson相关性分析检验TNBC中TAMs与MVD的相关性并做散点图，结果显示二者呈正相关(r=0.664，P<0.01)(图4)。

图2 TAMs表达与预后的关系Figure 2 Kaplan-Meier analysis for DFS and OS based on CD68 expression in TNBC

图3 MVD表达与预后的关系Figure 3 Kaplan-Meier analysis for DFS and OS based on CD34 expression in TNBC

表3 Cox单因素及多因素分析Table 3 Prognostic factors in the Cox proportional hazards model

图4 TAMs与MVD的关系Figure 4 Relationship between TAMs and MVD

3 讨论

本研究首次探讨了TAMs在TNBC中的表达及其与临床病理因素及预后的关系。研究发现，TAMs表达与TNBC肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、TNM分期及MVD显著相关；TAMs高表达者其5年DFS及OS均低于TAMs低表达者。Cox单因素及多因素分析显示TAMs高表达是TNBC预后不良的独立危险因素。

肿瘤间质细胞在肿瘤发生、发展及转移过程中发挥重要作用[4-5]。在肿瘤间质细胞中TAMs被认为是最重要的一员，所占比例可达50%～80%。研究发现TAMs通过直接和间接方式促进肿瘤的发生和发展[6]，具体机制包括：(1)促进肿瘤细胞分裂：TAMs可分泌生长因子如碱性成纤维细胞生长因子-2(bFGF-2)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)[7-8]等，直接促进肿瘤细胞分裂；(2)促进肿瘤血管的生成：一方面TAMs释放促血管生成因子和生长因子，如VEGF、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)和纤维素生长因子家族等；另一方面TAMs还可以表达调节血管生成的酶，如基质金属蛋白酶类MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12和环氧化酶-2(COX-2)[9-10]，以此促进血管生成；(3)诱导肿瘤浸润：TAMs能产生许多降解细胞外基质(ECM)的酶，如MMP-2、MMP-9和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)，通过促进ECM的降解而利于肿瘤细胞的侵袭和转移[11]；(4)参与免疫抑制与逃逸：TAMs分泌细胞因子如TGF-β、IL-13等，抑制淋巴细胞，如淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的增殖和分化，抑制抗肿瘤免疫的激活。TAMs的生物学功能提示其对肿瘤的发生、发展起促进作用，可能与肿瘤患者预后不良密切相关[12]。在前期研究中我们证实肿瘤间质内TAMs高表达的乳腺癌患者疾病进展快、易发生转移，预后较差[13-14]，但是目前对于TNBC中TAMs的表达及预后的关系研究较少。本研究进一步探讨TAMs在TNBC患者中表达的意义。

TNBC约占乳腺癌的15%～20%。TNBC具有发病年龄较轻，肿瘤侵袭性强，易复发、转移的特点，是乳腺癌中预后较差的类型[15]。因此，如何准确评估TNBC患者复发转移风险，对于控制疾病复发、提高患者生存尤为重要。目前有关TNBC预后评价指标主要为肿瘤大小、淋巴结转移状态等传统临床病理因素。Hernandez-Aya等[16]分析了1711例TNBC患病人群中淋巴结转移对预后的影响，结果表明淋巴结阴性TNBC患者的预后明显优于淋巴结阳性患者。Pistelli等[17]针对149例TNBC患者的一项回顾性分析显示肿瘤大小和淋巴血管侵犯是影响TNBC预后的独立因素。上述研究从肿瘤大小、淋巴结转移状态评估了TNBC复发转移的高危因素，而未探讨肿瘤患者体内免疫系统功能状态与患者复发转移的关系。有研究表明TAMs在肿瘤间质中的浸润在不同分子分型乳腺癌中可能存在表达差异[18]。本研究除了首次探讨TAMs表达对TNBC预后的影响，还发现TAMs表达与MVD密切相关，提示促进肿瘤血管生成可能是TAMs发挥作用的重要机制之一。那么，TNBC中的TAMs分泌哪些细胞因子，这些TAMs是否具有更强的免疫抑制功能等问题需要我们进一步深入研究。

TAMs与血管生成两者之间的相关性提示在乳腺癌的进展中TAMs促血管生成作用至关重要。在活体动物实验中，使用易患乳腺癌的转基因小鼠(PyMT)进行研究，结果显示抑制巨噬细胞的成熟和对肿瘤的浸润可以延迟血管发生和肿瘤进展，这为TAMs与乳腺癌血管生成的因果关系提供了更多的证据[19]，进一步证明了TAMs与乳腺癌血管生成密切相关。但对于乳腺癌中恶性度高的TNBC亚型，尚缺乏TAMs与血管生成关系的研究。MVD的测定可以量化血管的生成程度，在本研究中，结果显示TNBC中TAMs与MVD正相关，这与上述理论结果一致，TAMs可能通过促进血管的生成，进而促进了TNBC的发展。在一项针对25个独立研究的Meta分析中，高MVD与乳腺癌DFS和OS差显著相关(RFS和OS：RR=1.54，95%CI=1.29～1.84)[20]。目前关于MVD在TNBC中的测定及临床意义的研究很少。本研究探讨了MVD与TNBC病理因素及预后的关系，结果显示肿瘤体积较大、有淋巴结转移、恶性度高、TNM期别较高者MVD值高，这为MVD成为预测TNBC进展危险度的参考指标增加了临床依据。生存分析显示，高MVD者5年DFS较差，而与OS未见相关性，由于本实验为小样本量研究，这一结果还有待于进一步扩大样本量来验证。

综上所述，TAMs在TNBC的发生、演变中发挥了重要作用，是TNBC预后不良的独立危险因素。此外，肿瘤的发展离不开血管的生成，TAMs与TNBC中微血管生成关系密切，进一步支持了其促肿瘤的功能。这为判定TNBC预后提供了一个有价值的预后指标，也为今后个体化治疗提供了新的方法和思路。

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(收稿：2015-03-19)

The correlations between expression of tumor associated macrophages and the prognostic significances in triple negative breast cancer

YUChangyan，ZHENLina，LIHongbing，ZHANGYue，ZHANGQingyuan

Department of Medical Oncology，The Affiliated Tumor Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150081，China

Objective To explore the significances of expression of tumor associated macrophages(TAMs)and its correlation with microvessel density(MVD)in triple negative breast cancer(TNBC).Methods Immunohistochemistry was used to detect TAMs and MVD expression in 108 TNBC tissues and to analyze the correlation between TAMs with clinicopathological features，prognosis and MVD.Results The expression of TAMs was correlated with the tumor size，lymph node metastasis，histological grade，TNM stage and MVD，but had no statistically significant association with age.TAMs was correlated with 5 year disease free survival(DFS)and overall survival(OS)；MVD was correlated with 5 year DFS，while no correlation with OS.Univariate and multivariate analyses showed that TAMs was an independent unfavorable prognostic factor for patients with TNBC.Conclusion High infiltration of TAMs indicated poor survival rate for patients with TNBC.The infiltration of TAMs was a new，important risk factor for TNBC recurrence.TAMs were closely related to MVD，by promoting tumor angiogenesis，thereby promoting TNBC growth，invasion and metastasis，and further affect the prognosis of patients with TNBC.

Triple negative breast cancer；Tumor associated macrophages；Microvessel density；Prognosis

黑龙江省自然科学基金(重点项目)(ZD2016018)

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤内科(哈尔滨 150081)

余长艳，女，(1991-)，硕士研究生，从事免疫系统在肿瘤中功能变化解析的研究。

张悦，E-mail：18946114826@163.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.01.001